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干貨—以qPCR方法為例談談細胞治療數據分析方法驗證 （上篇）

德國耶拿生命科學部
2021.11.05

? ? ? ?細胞治療與基因治療行業目前正在蓬勃發展，每個新藥走上臨床都需要經過IND申報，在進行IND申報則必須要對產品質量控制的檢測方法進行開發和驗證，不論是委托第三方檢測，還是獨立完成，都需要根據2020藥典標準完成以下幾個項目的驗證：專屬性、準確度、精密度（包括重復性、中間精密度和重現性）、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。由于分析方法具有各自的特點，并隨分析對象而變化，因此需要視具體情況擬訂驗證的指標。

? ? ? ?我們以qPCR方法為例，來聊一聊如何設計實驗獲得數據完成這些驗證項目。

? ? ? ?1、專屬性Specificity

? ? ? ?專屬性是指在其他成分（如雜質、降解產物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能正確測定出被測物的能力。如方法專屬性不強，應采用多種不同原理的方法予以補充。

? ? ? ?鑒別反應、雜質檢査和含量測定方法，均應考察其專屬性。

? ? ?? 對于qPCR方法來說，需要設置陰性對照，陽性對照，空白對照，在陰性對照和空白對照無Ct值，陽性對照有效擴增的情況下，方才認定專屬性成立；

? ? ? ??2、準確度Accuracy

? ? ? ?準確度是指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。測定回收率R（recovery）的具體方法可采用“回收試驗法”和“加樣回收試驗法”。

? ? ? 根據準確度數據要求，有兩種方案。

? ? ? 第一種在線性范圍內，取同一濃度（相當于100%濃度水平）的供試品，用至少6份樣品的測定結果計算回收率進行評價。

? ? ? 第二種方案在線性范圍內，設計高中低3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品進行測定，用至少9份樣品的測定結果進行評價。

? ? ? 兩種方法的選定應考慮分析的目的和樣品的濃度范圍。對于有關物質檢查的準確度，還需對定量限水平的準確度進行評價。

? ? ? 對于qPCR方法來說，準確度的要求一般為回收率50~150%；這一驗證項目里，可能出現挑戰的在于低濃度樣本，因此需要一個靈敏度高，數據重復性好的儀器來進行實驗。

??? ? ?3、精密度Precision（包括重復性Repeatability、中間精密度Intermediateprecision和重現性Reproducibility）

? ? ? ?重復性是指在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度。

（如上圖所示，左邊的圖精密度良好，但是準確度不符合要求；右邊的圖平均值的準確度符合要求，但是精密度較差）?

? ? ? 重復性數據要求：在規定范圍內，取至少6份同一濃度（分析方法擬定的樣品測定濃度，相當于100%濃度水平）的供試品，即實測樣品，進行評價；或根據線性范圍，設計3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品進行測定，用至少9份樣品的測定結果進行評價。

? ? ? 注意，對于qPCR方法來說，這6份樣品或9份樣品需要在同一次實驗進行。

? ? ? 中間精密度是指在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定結果之間的精密度。中間精密度是考察隨機變動因素對精密度的影響，注意控制變量，每次只能驗證一個項目。

? ? ? 重現性是指在不同實驗室由不同分析人員測定結果之間的精密度。在分析方法從研發實驗室轉到QC實驗室的過程中，通常會進行重現性的考察。

? ? ??含量測定和雜質的定量測定都需要考察方法的精密度。

? ? ?精密度數據要求：對于qPCR方法，需要提供相對標準偏差RSD，計算公式如下，樣品中待測定成分含量和精密度RSD可接受范圍請參考ChP2021版中9101中可接受范圍表。

? ? ? 使用qPCR方法進行絕對定量時，要求RSD≤30%，這一要求不僅針對最終定量數據，對于儀器本身提供的Ct值的RSD也需要控制，儀器會提供一個SD值作為Ct值的精密度參考，一般以0.25為限。

? ? ???德國耶拿定量 PCR 儀在外源性宿主 DNA 殘留檢測方面有很多的實際應用案例，客戶的使用體驗反饋有：

l??儀器檢測靈敏度高

l??實驗數據的重復性好

l??運行速度快

l??中文軟件很好用

l??儀器運行很安靜

? ? ? 分析方法驗證介紹未完待續……

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