分析測試百科網 > 行業資訊 > 微信文章

【公開課】ABI 7500/7500Fast 程序實操指南及數據有效性分析方法

TIANGEN

2021.10.14

不知不覺開學已經一個多月了，相信科研小伙伴們也已經從理論學習進入了實操階段。在面對摩拳擦掌準備一次就成功完成qPCR 實驗的小白們，師兄師姐都難免囑咐一句：“學習理論只是實驗的第一步”，只有掌握實驗操作中的關鍵點和qPCR儀的程序設定，才能夠真正將理論轉化為實踐、獲得完美的實驗結果。

近期TIANGEN將與大家全面分享幾種實驗室常見熒光定量儀器的程序設定方法，并通過具體示例為您詳解qPCR實驗中的關鍵問題點，以及如何通過完善程序設置獲得有效的實驗數據。

ABI 7500 / 7500 Fast 熒光定量儀器

程序實操指南及數據有效性分析方法

? ?

公開課時長約40min，建議在wifi環境下觀看

今天分享的ABI 7500/7500Fast熒光定量儀器實操課，將帶您學習正確的設置程序和數據有效性分析方法，并有豐富的實驗示例解讀哦，快搬好小板凳認真聽講吧！

實驗屬性的設置

熒光試劑主要包括兩種：Taqman探針法試劑和SYBR Green I染料法試劑，由于兩種試劑的作用原理不同，要根據實驗目的選擇合適的試劑。SYBR Green I染料法試劑主要用于相對定量研究，而探針法試劑主要用于病原微生物核酸檢測或基因分型等方面的研究。

若選用ABI 7500Fast儀器，升降溫速度更快，40min左右即可完成反應，建議選擇匹配的快速定量試劑（如FastFire qPCR PreMix (SYBR Green)，目錄號FP207），會得到更理想的結果。

板面設置

? 標準曲線板面設置方法

標準曲線可以分為兩種，一種是絕對定量實驗中用已知濃度標準品進行倍比稀釋得出的標準曲線，另一種是利用未知濃度的cDNA進行倍比稀釋得出的相對標準曲線。兩種標準曲線都可以換算得出基因的擴增效率，不同之處在于前者主要用于檢測未知樣本濃度，后者可以輔助判斷cDNA模板的稀釋倍數。

?2-ΔΔCt相對定量實驗板面設置方法

在完成Target、Sample和生物學重復，以及內參基因（可以設置多內參基因）和參照樣本設置的前提下，實驗結束后軟件會自動計算出目標樣本相對于參照樣本的目的基因表達倍數。

ABI的熒光定量儀器在qPCR反應時要加內參染料，這樣可以校正反應孔之間的體系誤差，得到更精確的結果。

反應程序設置

反應程序可以在默認的程序基礎上根據qPCR試劑建議進行修改，如果需要縮短延伸時間，可以在Expert Mode一欄去掉未使用的熒光通道。熒光信號的收集需要在PCR延伸期和熔解曲線（染料法qPCR）溫度上升期進行。

為了提高操作的便利性，設置好的板面和反應程序可以保存為模板，運行時直接打開運行或者修改后運行。板面也可以在運行之后分析數據時設置。

數據有效性分析

擴增曲線主要看ROX熒光校正過的ΔRn vs Cycle圖，包括linear圖譜和log圖譜。熒光閾值要設置在指數擴增期，此時模板的log值與循環數之間存在負線性關系，后續的分析結果才會更準確。

熔解曲線如果是單一尖銳峰，代表產生的是特異的產物；如果出現雜峰，代表產生了非特異擴增或者引物二聚體，而此時對應的Ct值是不準確的，不能用于后續分析。

標準曲線的參數主要看擴增效率、R2和線性化范圍，擴增效率要在0.9-1.1之間，R2大于0.98，樣本濃度落在線性化范圍內，后續的分析結果才會更準確。

工欲善其事必先利其器，在掌握了正確的熒光定量實驗操作和儀器設置的基礎之上，選擇快速、高特異性、高靈敏度的qPCR試劑，能夠為您的實驗結果帶來錦上添花的效果。目前TIANGEN熒光定量全線產品火熱促銷中，請聯系銷售了解活動詳情。

Talent qPCR PreMix（SYBR Green）

目錄號：FP209

成就高特異性，高靈敏度的優質定量結果

?? 特異靈敏：高靈敏的抗體修飾聚合酶和獨特buffer組配，成就高特異性、高靈敏度的優質定量結果。

?? 全能：H-Competitor 因子競爭氫鍵，適用于普通模板，高GC 、復雜二級結構和長片段模板。

?? 抗抑制：EP 組分穩定PCR 體系，有效保護酶活，抵御各種抑制劑干擾。

利用TIANGEN FP209 及其它品牌熒光定量試劑檢測來自不同物種( 人類，大鼠，小鼠，水稻，小麥，玉米), 共24 個基因(GC 含量介于20%-73%)，1 μg RNA反轉錄cDNA 產物分別稀釋5 倍，50 倍，500 倍，5000 倍，50000 倍同時擴增檢測。利用前三個梯度熔解曲線判斷擴增特異性。利用第四或第五梯度熔解曲線判斷試劑的靈敏度。結果顯示，FP209 擴增特異性達到100%（24/24），擴增靈敏度達到83.3%（20/24），產品性能優異。

FastFire qPCR PreMix (SYBR Green)?

目錄號：FP207

ABI7500Fast快速程序的優秀選擇

?? 快速：低至30 min 即可獲得定量結果。

?? 靈敏穩定：Ct 值靠前，獨特的穩定劑和增強劑使結果更準確、重復性好。

?? 適用性廣：適用于快速及普通熒光定量PCR 儀。