本篇文章已經開通留言功能，

歡迎至文末留言交流討論！

反相色譜肽分離色譜柱和流動相研究

第四部分 表征流動相的選擇性

本文對多種流動相組合進行了研究，對具有不同功能的肽探針表現出不同色譜選擇性（即稱為表征）的亞類之間的流動相組成進行了區分，從而揭示了多模式保留機制的可能性。由于在給定流動相條件下肽保留機制的復雜性，沒有嘗試解釋這些，而是簡單地將流動相分類為不同的組，目的是確定那些產生不同選擇性的組，以用于分析肽混合物的方法開發路線圖的策略。在Ascentis Express C18色譜柱用不同 pH 值（范圍 1.8 – 7.8）、鹽類型、離子強度、離子對試劑和離液鹽/趨液鹽添加劑的 51 種 RPC 流動相組成研究9 種合成探針肽（牛 GLP-2 片段）色譜選擇性的差異。用主成分分析（PCA）的化學計量學工具可視化所評估的各種流動相產生的選擇性差異結果。利用PCA對所評估的各種流動相參數的相對重要性進行排序。這種方法的概念在含有合成相關雜質的牛GLP-2（1-15）樣品的分析中得到證實。比較C18色譜柱另外三種有明顯選擇性差異的固定相（烷基酰胺、氟苯基和聯苯）。除離子對試劑外，C18、氟苯基和聯苯類色譜柱也獲得了類似的趨勢，這暗示了這些發現適用于絕大多數適用于肽分析的RPC色譜柱。本研究結果強調了篩選不同pH值、離子對試劑和離子強度的多種流動相的重要性，以便最大限度地提高在復雜混合物中分離所有目標肽的可能性。

01介紹

已有大量已發表的信息關于離子對試劑[1-6]、pH值[7-10]、溫度[6,7,11-13]、流動相組成[7,8,10]和不同固定相[6,7]對反相LC中肽保留和選擇性預測的機理效應。Hodges、Hearn、Krokhin和Gilar團隊進行了廣泛的研究，以增強目前對RP色譜柱上肽保留機制的理解[6,8,9,14-26]。在C18色譜柱上，通常使用流動相pH值為2和7進行肽分離，使用或不使用離子對試劑，離子對試劑與肽分子內的質子化氨基官能團（例如：組氨酸、賴氨酸和精氨酸殘基以及N端氨基）相互作用。已有報道，評估具有不同疏水性的離子對試劑對特定肽分離的潛在價值[1,5]。由于多肽在不同的有機/水性環境中可以表現出不同的二級結構，以及肽在不同pH值下表現出的凈電荷和電荷分布，因此優化復雜肽混合物的分離條件并非易事。這可能導致保留機制的隨著流動相組成的變化而改變。

迄今為止，尚未有一項全面的研究旨在比較和表征（即分類）由不同鹽、離子對試劑和具有不同固定相的pH值組成的各種流動相。由于近年來對生物制藥開發的興趣日益濃厚，因此需要識別并選擇流動相和固定相，從而為色譜工作者提供在復雜混合物中分離相關肽組分的最佳方案。本文的主要重點是利用化學計量學工具，根據流動相產生的選擇性特征，將51種新型和常用的流動相組合識別和表征為不同的組合。

為分離、鑒定和定量相關肽中的雜質，必須同時實現良好的選擇性和峰形。因此，除了主要關注選擇性外，還需評估流動相添加劑對肽峰形的影響，以及對所選目標流動相的分析物過載的影響。文獻表明，選擇性和峰形都高度依賴于分析物，因此色譜工作者可以選擇研究一系列不同的流動相，尋找到為特定應用產生最佳分辨率的條件非常重要。

本文是系列文章中的第四篇，該系列論文涉及使用反相色譜法（RPC）最大限度地提高肽分離的色譜選擇性。該系列的第一至第三篇論文分別重點介紹了使用26個專門設計的肽探針[27]開發色譜柱表征方案、優化方案[28]的穩健性以及38個不同固定相的表征[29]。該表征方案基于33個氨基酸肽-牛GLP-2（參見表1和參考文獻[27–29]）確定9個選定探針之間的保留時間差異，該方案已被證明可以通過肽探針的疏水性、靜電性、氫鍵和與固定相的芳香相互作用成功地區分不同類型的反相固定相。此外，固定相分離非對映異構體或異構體探針的能力[27]。第四篇論文將表征方案的使用擴展到51種新型和常用的MS兼容和非兼容流動相。除了不同的pH緩沖液外，評估還包括一系列疏水性和電荷不同的離子對試劑（七氟丁酸（HFBA）、三氟乙酸（TFA）、二氟乙酸（DFA）、丁基磺酸鈉（BuSO3Na）和三乙胺（TEA））、離液鹽高氯酸鈉（NaClO4）和六氟磷酸銨（NH4PF6）或趨液鹽硫酸鈉或硫酸銨（Na2SO4或（NH4）2SO4）， 離子強度 （IS） 和一系列雜項改性劑（甲酸 （FA）、磷酸 （H3PO4）、甲磺酸 （MSA）、甲酸銨 （NH4FA）、乙酸銨 （NH4AA） 和碳酸氫銨 （NH4HCO3））的影響（見表 2）。還評估了MS兼容添加劑在電噴霧電離質譜（ESI-MS）正電模式中產生的信號強度。用主成分分析（PCA）的高度圖形化化學計量工具提供流動相添加劑之間選擇性差異和相似性的簡單可視化，并根據流動相成分對肽探針產生的選擇性分布來識別和分組不同的亞類。

本研究將有助于選擇有限數量的可用于最大限度地提高給定色譜柱的選擇性的流動相。首先在具有代表性的新一代C18色譜柱上研究大范圍篩選流動相。然后確定是否可以使用有限數量的流動相（顯示在C18相上具有較大的選擇性差異），再將這些發現外推到一系列其他不同的反相色譜柱（顯示在兩個流動相中提供最大的選擇性[29]）。希望這些發現可用于在RP-LC方法開發策略中確定合適的初始流動相和固定相組合，從而提供最佳的肽分離。

02實驗

2.1. 化學品和試劑

使用的所有水、乙腈和流動相添加劑（甲酸銨 （AF） 和甲酸 （FA））均為 LC-MS 級，由 Sigma Aldrich（Poole, UK）提供。二甲基亞砜（DMSO）由Fisher Scientific（Hemel Hempstead, UK）提供。由Apigenex（Prague, Czech Republic）提供的肽全部溶解在DMSO /H2O（80：20 v/v）中，濃度為0.25 mg/mL。每種肽的堿基序列都位于[27]，肽探針的進一步描述見表1。

表1

2.2. 儀器

在島津Nexera X2 UHPLC系統（Duisburg, Germany）進行LC分離，該系統配備了兩個二元泵（LC-30AD）和比例閥、脫氣機（DGU-20ASR）、具有冷卻功能的自動進樣器（SIL-30AC）、Prominence柱式烘箱（CTO-20AC）、二極管陣列檢測器（SPD-M30A）和通信總線模塊（CBM-20A）。島津單四極桿質譜儀（LCMS 2020）被用作二級檢測器。LC儀器的梯度滯留體積為342 μL，系統保留體積為14 μL [32] .MS研究是在配備PDA和Waters Synapt G2-Si Q-TOF（Wilmslow, UK）的Waters Acquity I-Class上進行的。

2.3. 固定相

在同一批次的Ascentis Express C18（150×2.1 mm色譜柱尺寸，2.7 μm粒徑，Supelco，Bellefonte，PA，USA）上評估了所有流動相。每個離子對都使用專用色譜柱，以避免流動相之間的記憶效應。選擇Polaris Amide C18（150× 2.0 mm，3 μm，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）、Acquity CSH Fluoro Phenyl（150 × 2.1 mm，1.7 μm，Waters，Milford，MA，USA）和Ascentis Express Biphenyl（150× 2.1 mm，2.7 μm）作為參比的固定相，以確定Ascentis Express C18結果在其他類型的固定相上的適用性[29]。在Acquity CSH C18（150× 1.0 mm，1.7 μm）上進行MS響應比較，該色譜柱利用了150 × 2.1 mm色譜柱上的平移梯度。每個固定相的簡要描述可以在參考文獻[29]的表2中找到。水峰被用作死時間標記[32]。

2.4. 流動相表征方案

如表2所述制備預混流動相，用于A相。使用MeCN / H2O（80：20 v / v）制備B相。B相不和A相做添加劑匹配，以防止溶劑浪費，并將溶劑和實驗的數量保持在可接受的水平。梯度標準化如下：40 分鐘內 5.6% 至 62.5%B，在梯度頂部等度保持 2 分鐘，然后在 0.1 分鐘和 10 分鐘重新平衡（相當于 10 個色譜柱體積）后恢復到原始條件。柱溫為40°C，流速為0.3 mL/min，檢測波長為215 nm，帶寬8 nm，參考波長為360 nm，帶寬為100 nm。在PDA之后安裝了帶電噴霧電離功能的島津2020單四極桿儀器，以在適用的情況下在正電SIM模式下識別峰值。使用正ESI模式電離對Synapt G2-Si MS進行了比較不同緩沖液性能的MS研究，源溫度為120°C、毛細管電壓為3.5 kV、脫溶劑化溫度為250°C、脫溶劑化氣體流量為750 L/hr、霧化器氣體壓力為6.0 bar、錐體氣體流量為50 L/hr和掃描時間為0.250 s，。將質量范圍設置為100 – 2000以觀察任何加合物的形成，并應用高分辨率模式。

2.5.軟件和計算

使用LabSolutions控制液相色譜儀器并進行數據處理 (Version 5.86, Shimadzu, Duisburg, Germany). 使用(SIMCA (Version 14.1, Umetrics, Ume?, Sweden)和 Origin (Version OriginPro 2016, OriginLab, Northampton, MA, USA) 做主成分分析。使用GPMAW software (Version 9.51, Lighthouse Data, Odense, Denmark)計算電荷。

03

結果和討論

3.1. 流動相的選擇

評估由不同鹽、離子強度、陰離子/陽離子對試劑、離液/趨液鹽在不同pH值（pH 1.8 - 7.8）下的一系列流動相，以評估它們對一系列具有不同物理/化學性質的肽的選擇性。表2包含緩沖液、pH值、總離子強度、流動相組成及其MS相容性。選擇流動相組合物\\的理由可在補充材料中找到。

3.2. pH的影響

肽在疏水性RP固定相上的保留取決于流動相pH值，因為流動相pH值會影響其凈電離狀態（例如，天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸殘基中肽的C端和N端和/或側鏈的電離），這反過來又決定了它們的親水性以及它們與離子對試劑相互作用的傾向。表1顯示了所用每種肽探針的凈電荷和電離堿性/酸性部分的數量。此外，pH值會影響硅醇基團在二氧化硅基固定相上的電離態以及制造商賦予的任何氨基官能團（即帶電表面雜化相），因此這將影響帶電肽和電離固定相表面的靜電吸引/排斥。

使用PCA評估結果，前兩個主成分描述了數據集中約92%的變異性。第三個主要組成部分并沒有大幅增加這一數值，反而增加了評價的復雜性。因此，該研究未使用它。第一個主成分描述了大約62%的數據變異性，并且正如預期的那樣，包含與靜電相互作用相關的Δ（9,1）和Δ（26,13）（即變量）[29]，它們在圖1中彼此截然相反。除了肽電荷對選擇性的預期影響外，第一主成分還受到芳香族、酚類基團和蛋氨酸殘基的不同氧化態的影響，分別由Delta值Δ（16,13）、Δ（24,13）、Δ（8a，1）表示——這些Delta值可能描述了親水性的增加（即疏水性苯基的損失， 酚基的添加和硫化物的轉化形成氫鍵的偶極相互作用的亞砜）。第二個主成分描述了大約 30% 的變異性，其中結果主要受基于二圖中 delta 值 Δ （14,13） 和 Δ 15,13） 位置的空間參數的影響（圖 1）。

圖1

圖2

PCA貢獻圖表示兩種流動相（即觀測值）所賦予的選擇性的差異。僅pH值變化的流動相（MP46、44、36、42、29、23和4）的貢獻圖（數據未顯示）表明，Δ（26,13）值隨pH值的增加而增加，突出了帶正電荷的肽26號和帶負電荷的二氧化硅表面之間的靜電吸引力增加。同時，Δ （9,1） 值隨著 pH 值的增加而降低，突出了帶負電荷的肽 9 和帶負電荷的二氧化硅表面之間的靜電排斥力增加。隨著流動相pH值的堿性增加（從正凈電荷切換到負凈電荷），1號和9號肽的保留降低，而26號肽的保留增加，即使在pH>7時，仍保留總凈正電荷。在低pH值下，親水肽的洗脫順序為1號，在9號之前（均顯示凈正電荷），而在pH>7時，有一個洗脫開關，其中9號肽在1號肽之前洗脫，因為9號肽現在具有-5電荷，而1號肽（-4凈電荷）因此9號肽的親水性更強，并且對電離的硅醇基團也表現出更大的靜電排斥力。有趣的是，Δ （16,13）、Δ （24,13）、Δ （8a，1） 值都隨著 pH 值的增加而增加，表明隨著肽羧酸部分逐漸去質子化，這些親水項的優勢增強。空間參數 Δ （14,13） 在 pH 值 3.6 和 5.1 之間最大，表明評估一系列 pH 值的重要性。圖2A突出顯示了在低pH值下觀察到各種添加劑之間的最大選擇性差異這一事實。隨著流動相pH值的逐漸增加，添加劑之間觀察到的選擇性差異減小（即在pH 6.0時觀察到流動相的擴散更大）。這可以通過在中等pH值下降低離子對形成的傾向來合理化，因為除了26號肽外，所有肽都具有負或中性凈電荷。雖然疏水相互作用通常在肽的 RPC 中占主導地位，但其他類型的相互作用（如偶極子：偶極子和 π：π 相互作用）對于產生微小的保留差異可能很重要，從而可以提高選擇性。結果表明，在優化肽分離的選擇性時，pH值應是一個需要探索的主要參數。

使用pH 2.3、3.6、5.1和7.5的20 mM緩沖液比較含有合成雜質的牛GLP-2（1-15）樣品。補充材料中的色譜圖S1說明了在方法開發策略中篩選不同pH流動相時可以獲得的選擇性的巨大差異。由于練習的目的是說明選擇性差異，因此沒有做峰匹配; 而且鑒定需要2D-LC/MS，因為流動相含有不揮發性鹽。

3.3. 離子對試劑的作用

先前有文章介紹，不同疏水性的肽需要不同的離子對試劑才能實現最佳分離[1,5]，例如疏水性離子對試劑TFA和HFBA以及陰離子離液鹽ClO4- 對親水性肽的分離效果更好[1,3,5]。HFBA是一種非常有效的離子對試劑，可增強親水性肽在C18色譜柱上的保留。而親水性磷酸鹽離子對試劑已被證明對疏水肽分離是成功的[1,5]。這凸顯了評估具有不同表觀疏水性的各種離子對試劑/反離子在分析特定肽分離方面的價值。因為在現實生活中可能存在一系列具有各種帶電狀態的肽，因此在 pH 值范圍 1.8 至 7.8 范圍內評估陰離子和陽離子對試劑的效果。

比較不同疏水性的陰離子（TFA、HFBA和BuSO3Na）和陽離子（TEA）離子對試劑對肽選擇性的影響，以及沒有任何電離對試劑作為流動相pH值的函數。離液添加劑NaClO4和NH4PF6也包括在內，因為它們也具有離子對特性[33]。從pH值為2.3的PCA Bi-plot圖（圖1）在20 mM磷酸銨緩沖液中發現，對于這種特異性分離，含有或不含TFA的流動相（MP5和4）之間的選擇性差異似乎很小。與TFA相比，含有BuSO3Na和HFBA（分別為MP2和13）的流動相具有不同的選擇性，這凸顯了篩選不同離子對試劑的重要性。含有疏水性離子對試劑的流動相對所有攜帶正凈電荷的肽的保留時間更長（即在pH 2.3時為+1.1至+3.4），從而產生更疏水的離子對，與C18固定相的相互作用更強。肽的保留與離子對試劑的疏水性一致（即無離子對<TFA < BuSO3Na < HFBA）。HFBA與不含離子對的流動相的暴露效果在含有幾種合成雜質的牛GLP-2樣品（1-15）上得到了證明（數據未顯示）。

將廣泛使用的0.1% v/v TFA （MP11）流動相條件與含有0.1% v/v FA （MP1）、0.1% v/v H3PO4 （MP3）和20 mM HFBA （MP14）的流動相條件進行比較，發現選擇性差異顯著。由于 TFA 在 質譜中產生較低的正離子 ESI 信號，因此一般將 TFA 與 FA （MP15） 結合使用或用 DFA （MP7） 代替。從PCA雙圖中可以看出，與TFA相比，這些替代方法之間存在小到中等的選擇性差異。

一般來說，帶正電荷的肽的保留隨著離子對試劑的疏水性、肽上正電荷的數量和離子對試劑的濃度而增加。增加的幅度取決于肽的疏水性，例如，更多的親水性肽比其相應的疏水類似物表現出更大的保留時間偏移[14]。這凸顯了在帶正電荷的肽分離優化時微調這些疏水陰離子對試劑的疏水性和/或濃度的重要性。

圖 1 突出顯示，離液添加劑 NaClO4?（MP16） 和 NH4PF6?（MP18） 也可以作為陰離子離子對添加劑，與其他評估的離子對試劑相比，產生的選擇性特征明顯不同。Hodges等人先前觀察到，陰離子在形成離子對方面的有效性遵循CCl?<<TFA?<ClO4?[3]和PO4?<TFA?<HFBA?[5]的趨勢，這反映了與肽形成的離子對的保留。氯化物陰離子具有親水性，可以簡單地中和肽上的正電荷，從而降低肽的整體親水性，從而增加對RP固定相的保留。在100 mM磷酸鹽中pH值為2.3的結果表明，本研究中肽的保留遵循洗脫順序SO42? < PO4? ≈ Cl?<< ClO4? < PF6?，這是Hofmeister 級數序列的重現，Hofmeister 級數序列反應了離子影響水結構的能力 [34-35]。Hodges等人認為，ClO4?陰離子在增加肽的疏水性方面比TFA更有效，因為ClO4-陰離子具有很強的離液特性（即水結構破壞），ClO4?陰離子對附近水分子的競爭效率不如大塊水團，因此比Cl?和TFA?等離子更容易脫水[3]。有人認為，離子對的形成需要將水分子排除在帶正電荷和帶負電荷的物質之間的相互作用之外（即陰離子必須脫水才能形成具有肽質子化氨基官能團的離子對）[3]。Hodges等人指出，ClO4?陰離子比TFA?陰離子更容易脫水，這可能部分解釋了ClO4?陰離子作為離子對試劑的有效性，盡管后者更疏水[3]。

推測TFA中和了與肽相關的正電荷，并且隨著其疏水性的增加，增強了肽的疏水性。

NH4PF6 （MP18） 最近在堿性小分子分析物分析中顯示出良好的應用前景 [33]，其在評估的陰離子離子對試劑中產生了最大的選擇性差異，與 NaClO4 相比，對 +3.4 帶電荷的肽編號 26 的保留率更高。有趣的是，NH4PF6 只能在 pH 值 2.3 下表征，因為它在 pH 值 ≥3.6 （MP48-50） 下的紫外吸光度非常高，因此除非在低 pH 值下使用，否則在色譜上是不切實際的。正如預期的那樣，陰離子對試劑TFA、NaClO4和BuSO3Na在pH 7.5下表現出與PCA biplot圖（圖1）相似的選擇性，因為離子對的形成比低pH值時少。在酸性環境中，所有肽探針的正電荷量明顯大于負電荷，這促進了與陰離子離子對試劑的離子對形成，而在中間pH值下，肽上存在正電荷和負電荷的混合物。這產生了一個整體中性或帶負電荷的肽表面，該表面不太可能與帶負電荷的離子對試劑相互作用。此外，肽上的任何負電荷都可能排斥陰離子對試劑，從而減少離子對的形成[36]。在pH 6.8下含有疏水性HFBA陰離子對試劑的MP51強調了這一點，因為親水肽（肽編號1、8和9，凈電荷為-4至-5）由于與吸附在C18表面的HFBA陰離子的靜電排斥而無保留。在控制保留方面，肽上帶電官能團的位置及其可及性和形成離子對或與其他離子物質相互作用的能力可能與肽的總凈電荷一樣重要（見表1）。據報道，HFBA是一種用于分離肽的可行離子對試劑[17,30,37-39]，在pH值在2.3至5.1之間，與不含任何離子對試劑的流動相相比，HFBA具有不同的選擇性，如它們在評分圖中的位置所示（圖2B）。這已通過含有合成雜質的牛GLP-2（1-15）樣品進行了驗證（數據未顯示）。HFBA的使用不如TFA，因為已知HFBA在LC系統中會引起記憶效應和UV基線噪音，因此需要對LC/MS儀器進行大量清潔[40]。記憶效應[41]是由于這些疏水離子對對疏水固定相具有非常強的親和力。原則上，它們可以通過用有機溶劑洗滌來去除，但是，在實踐中，色譜柱的初始特性可能已經永久改變，因此色譜柱無法再生回其原始狀態。通常，這就意味著一旦色譜柱暴露于離子對試劑中，它就應該專用于該特定分析。全氟添加劑也存在潛在問題，因為含有聚四氟乙烯AF（無定形含氟聚合物）的LC管路可能會隨著時間的推移而受到影響，導致聚合物的物理變化和流動相的污染[42,43]。

在pH 5.1下，陽離子對試劑TEA（MP28）產生的選擇性特征與陰離子離子對試劑（MP31、32和33）不同。在低pH值下，陰離子對試劑NH4PF6和BuSO3Na之間的離子對試劑之間的選擇性差異最大（圖2B），其中所有評估的肽在pH 2.3下具有+1.1至+3.4的總電荷。在圖2B中繪制的每個觀察值（即流動相）的坐標突出顯示，從低pH值到中等pH值存在收斂趨勢（圖2B）。正如預期的那樣，所有離子對試劑的行為都相似，在低pH值下選擇性差異更大，由于缺乏離子對形成，在中等pH值下，由于大多數肽表現出中性或負凈電荷，因此選擇性差異變窄。

甲磺酸（MSA）具有很有前途的替代選擇性[30,31]、紫外線透明度和MS兼容性，在RPC作為小分子和大生物分子（如單克隆抗體）的添加劑的使用有所增加。McCalley認為，與TFA和銨鹽相比，MSA可以提供不同的選擇性[30]。MSA表現出最小的離子對效應，并且可能比TFA更具優勢。潛在問題是存在對液相色譜體系內的金屬部件腐蝕[44-46]，因此強烈建議在使用后沖洗以防止部件損壞[45]。圖1突出顯示，與表征中使用的肽相比，MSA（MP17）產生的選擇性特征不同。有趣的是，MSA導致肽的保留增強，保留順序如下：FA<<TFA<<MSA<HFBA，表明可能與MSA形成離子對。

比較陽離子或陰離子離子對試劑對峰形影響時，在pH值范圍1.8至7.8的pH范圍內，超載樣品獲得的不對稱值似乎沒有差異。在沒有離子對試劑的情況下，觀察到較大的不對稱值，特別是在中間pH值下，尤為明顯。

3.4. 趨液鹽和離液鹽的效用

趨液性（例如SO42?離子）和離液性（例如PF6-和ClO4?）鹽分別是對水結構的形成和破壞，它們會影響肽和蛋白質的溶劑化外殼，會影響肽與固定相相互作用的方式。趨液性和離液性鹽都遵循Hofmeister級數[11,12]，該級數描述了鹽化蛋白質所需的最低濃度[47-52]。如第3.3節所示，離液鹽PF6和ClO4也是陰離子對試劑，在低pH值下產生了有趣的選擇性。離液劑（ClO4- 和 PF6-? （分別為 MP16 和 18））在評分圖中的位置（圖 1 和圖 2C）表明，與趨液性 SO42? 和 Cl? 鹽（即 MP9 和 10）相比，選擇性差異要大得多。評估的兩種趨液鹽（NH4）2SO4和Na2SO4（分別為MP8和9）顯示出很小的選擇性差異，這表明陽離子對選擇性的影響很小。一般而言，使用SO42?添加劑可獲得良好的峰形，但是，使用含有SO42?的流動相，9種肽中的3種肽存在明顯的拖尾現象（見圖3B）。相比之下，當不添加鹽或添加NaCl時，觀察到出色的峰形（圖3A和C，總IS為100 mM）。觀察到的三個肽編號 16、24 和 26 的不良形狀可歸因于“鹽析效應”，這與肽的總凈電荷無關。

圖3

ClO4- 離液鹽具有明顯的選擇性差異，盡管出于健康、安全和環境考慮，不建議使用 ClO4- 。然而，如果關鍵物質難以解決，它可能是一種有用的替代流動相添加劑。PF6-添加劑在選擇性方面也存在更大的差異，并且不表現出爆炸性。PF6-顯然是一種有趣的添加劑，然而，目前其長期使用的經驗有限，還存在PF6-在水溶液中產生HF的潛在風險，這可能導致固定相的配基斷裂[53]。

3.5. 離子強度和峰形

在流動相中加入鹽旨在抑制二氧化硅表面帶負電荷的硅醇基團與帶正電荷的肽之間的靜電相互作用，從而改善峰形。使用20mM 離子強度的緩沖液評估鹽的效果，通過添加鹽提供的總離子強度為100mM，再進行比較。離子強度已被證明對色譜性能至關重要[15,54-57]。由于多種保留機制的混合物，色譜柱上分析物的質量過載會產生不對稱/拖尾峰。對于肽為帶電物質，通常會相互排斥，這種排斥隨著肽濃度在固定相中的增加而增加。通過增加離子強度，相互排斥減少，如McCalley等[57]所述。

在非超載狀態下用表征方案[29]對相關肽進行色譜分析，此時峰容量和不對稱性的影響不大。對牛GLP-2（1-15）的超載樣品進行了比較，以突出在峰形上使用增加離子強度的優勢。使用100 mM 離子強度的鹽和離液鹽的對超載牛GLP-2（1-15）樣品進行研究，其不對稱值范圍為0.90至2.69（平均1.40），與20 mM IS流動相（0.99至4.21，平均2.82）相比有所改善。表2中指定的流動相添加劑僅在A溶劑中制備，因此在洗脫點的柱出口中實際的離子強度較低（即30%）。還評估了常用的添加劑 0.1% v/v FA、0.1% v/v TFA 和 20 mM IS TFA（圖 4）。

圖4

在制藥行業中，經常使用磷酸鹽緩沖液代替TFA，因為峰形通常更優越，可以改善UV基線，可觀察到較低的定量限。超載牛GLP-2（1-15）樣品在離子強度流動相低于10 mM時表現出明顯的拖尾現象，特別是0.1% v/v FA。0.1% v/v TFA和20 mM TFA的不對稱性得到改善，但峰的拖尾大于2.0。在洗脫峰期間，離子強度大于20 mM的流動相通常接近高斯對稱，說明該肽的色譜分析需要增加離子強度。鹽的類型似乎對峰的對稱性沒有太大影響。這證實了Hodges等人報告的發現，他們觀察到含有50 mM NaCl和NaClO4鹽的流動相改善了峰形[15]。圖5顯示了改善的峰形，該圖比較了pH 2.5 0.1% v/v FA和pH 3.6 20 mM NH4FA / FA流動相對含有合成雜質的牛GLP-2樣品（1-15）峰形的影響。

與常用的磷酸銨、鈉或硫酸銨（圖3B）相比，它們存在有機相水平升高后帶來的鹽沉淀和/或肽沉淀的潛在問題，已經證明NaCl（圖3C）可能是使用硫酸鹽或磷酸鹽的可行替代品，因為與硫酸鹽相比，NaCl在100 mM離子強度下產生更好的峰形，并且比磷酸鹽具有更好的溶解度。然而，在低pH值下使用NaCl時必須小心，因為它可能會轉化為HCl，這可能會對LC系統產生腐蝕性并限制其適用性。

3.6. 固定相對流動相的影響

接下來在另外三種色譜上不同的固定相（Ascentis Express Biphenyl、Polaris Amide C18和Acquity CSH Fluoro Phenyl）上評估了六種不同的流動相，這些流動相在PCA bi-plot圖（圖1）中表現出中等到較大的選擇性差異，在肽反相色譜柱表征方案中顯示出較大的選擇性差異[29]。六種不同的流動相在pH 1.9和7.5之間變化，離子強度不同。選擇0.1% v/v FA pH 2.5 （MP1）和0.1% v/v TFA，pH 1.9 （MP11），因為它們可能是最常用的低pH值肽流動相添加劑，后者是一種適用于增強保留的離子對試劑。選擇MS兼容和非兼容流動相，分別為20 mM NH4FA pH 6.5 （MP42）和NH4H2PO4 / （NH4）2HPO4 pH 7.5 （MP44），因為它們代表了常見的中間pH添加劑。選擇含有離子對試劑 20 mM AA / NH4AA / BuSO3Na pH 5.1 （MP32） 的流動相，因為它表現出選擇性差異。此外，還包括低pH流動相100 mM H3PO4 / NH4H2PO4 / （NH4）2SO4 pH 2.3 （MP8），因為諾和諾德的經驗表明，它通常比普遍使用的TFA產生更好的峰形和選擇性。

將不同流動相/固定相組合的選擇性與先前確定的Ascentis Express C18進行比較，以確定它們在分數圖中的相似性（即Ascentis Express C18的結果和結論是否可以應用于更大范圍的固定相）。Ascentis Express Bibenzyl（參見補充材料圖 S2B）和 Acquity CSH 氟苯基（參見補充材料圖 S2C）在評估的流動相方面呈現出與 Ascentis Express C18（參見補充材料圖 S2A）相似的模式。這表明中性、負電/極性和弱正電固定相的反應相似，因為它們在Score Plot圖中產生了相似的模式。MP32（pH 5.1 20 mM AA / NH4AA / BuSO3Na）的行為不同，這種偏差可能是由于離子對試劑與附著在固定相表面的C18、聯苯或丙基五氟苯配體相互作用[58-60]。這可能會改變肽與離子對試劑和固定相的相互作用方式，從而可能提供不同的選擇性曲線。補充材料圖S2C中MP44的Delta值（即Acquity CSH氟苯基在pH 7.5下）無法獲得，因為親水肽（肽編號1、8和9，凈電荷為-4至-5）在過早洗脫，因為它們在這種低保留固定相表面上與負電荷的硅醇基團發生靜電排斥。盡管有BuSO3Na流動相的結果，但令人鼓舞的觀察結果是，中性、負電性/極性和弱正電性固定相的行為方式相似，這表明這些結果應該可以拓展應用到的市售色譜柱上。

Polaris Amide C18的分數圖（見補充材料圖S2D）中的模式具有很高的正電特性，表明這種類型色譜柱與中性的Ascentis Express C18之間沒有相關性。此外，使用肽反相色譜柱表征方案[29]，也觀察到Polaris Amide C18相會產生較大的選擇性差異，因此，可以合理地預期，與C18色譜柱相比，該固定相在流動相范圍內的行為會有所不同。MP42 （pH 6.5） 與 MP1 （pH 2.5） 作為四個固定相的函數的貢獻圖（數據未顯示）突出了 C18、聯苯和氟苯基相響應之間的相似性。后三種在pH 6.5時由于二氧化硅表面的電離增加，與pH 2.5相比表現出更大的親水性（Δ（8a，1），Δ（16,13），Δ（24,13）），正靜電相互作用（Δ（26,13））和較低的負電排斥描述符（Δ（9,1））。相比之下，帶正電荷的Polaris Amide C18固定相表現出較低的靜電相互作用（Δ（26,13））和親水性（Δ（8a，1），Δ（16,13），Δ（24,13））描述符，因為色譜柱上的正電荷抵消了pH 6.5時電離硅醇基團增加的負電荷。這種對固定相的有限評估表明，Ascentis Express C18的結果可以應用于由中性、負電/極性和弱正電固定相組成的色譜柱組，即大多數市售色譜柱。在固定相具有巨大選擇性差異的情況下，流動相表征結果不太適用。

3.7. 質譜響應

1號肽（牛GLP-2（1-15））在正電模式電噴霧電離（ESI）中的MS信號強度被評估為補充材料表S1中所示的一系列揮發性流動相添加劑的函數。MS信號的強度范圍在6E+02至2E+05之間，顯示出不同流動相添加劑之間的MS信號強度差異很大。MS信號強度。對應于pH 2.5 0.1% v/v FA （MP1）和pH 7.8 20 mM FA / NH4HCO3 / TEA （MP37）的流動相分別給出了最大和最小的大量揮發性流動相的MS響應%（與FA（MP1）相比）在0-10%之間，其中包括一些常用的MS添加劑，如pH 6.5 20 mM NH4FA （MP42）、pH 7.0 20 mM NH4AA （MP36）和pH 7.8 20 mM NH4HCO3 （MP46）。與FA相比，普遍使用的pH 1.9 0.1% v/v TFA（MP11）僅產生20%的響應，這與先前的報道一致[38]。在流動相（MP15）中用FA代替50%的TFA部分糾正了ESI正離子靈敏度降低的情況[38,61]。由于純度低且金屬含量高，DFA歷來避免作為LC/MS的添加劑[62]，然而，由于生產工藝的改進，DFA（MP7）的質量最近有所提高，使其成為TFA（MP11）的可行替代品[63]。在pH 1.9的測試條件下，13 mM 0.1% v/v DFA （MP7） 產生了 50% 的響應（比 TFA 高 2.5 倍）。有趣的是，與FA相比，不常用的pH 1.9 0.1% v/v MSA（MP17）產生了15%的合理MS響應。對于所有添加劑，加合物的形成被忽略不計。

含有揮發性離子對試劑TEA（MP21、28、31和37）和HFBA（MP14、26和33）的流動相對該肽的MS信號響應較差，通常禁止其用于低雜質測量。HFBA還會引起記憶效應，需要對MS儀器進行大量清潔[40]。

在將這些發現外推到其他肽時必須謹慎，因為 MS 響應高度依賴于分析物和 MS 操作條件。甲酸通常被認為是生成高靈敏度陽性模式ESI-MS的“金標準”，但不幸的是，與TFA或磷酸鹽緩沖液相比，甲酸的峰形較差[57]。當使用 TFA 時，觀察到 MS 反應顯著降低，這表明應考慮 用DFA 替換 TFA，因為DFA帶來 MS 信號的減少并不那么明顯。結果表明，在pH范圍內具有不同選擇性性質的揮發性流動相添加劑應產生與常用的0.1%TFA相當的可接受的MS響應。

04結論

本文使用PCA的化學計量學工具可視化不同流動相之間可能產生的巨大選擇性差異。結果強調了篩選不同pH和離子對試劑的幾種流動相的重要性，最大限度地提高在復雜混合物中分離所有目標肽的可能性。PCA表明，對于這一特定范圍的肽，當離子對試劑在合適的pH值下使用時，它們會產生很大的選擇性差異，從而促進離子對的形成。PCA評分圖（圖2）和幾何距離（數據未顯示）突出顯示，陰離子離子對試劑HFBA、ClO4和PF6對低pH值下離子對試劑的選擇性影響最大。4種不同色譜柱和6種不同流動相的PCA評分圖和幾何距離（圖S2）表明，流動相參數對選擇性的相對重要性為：pH值和色譜柱類型>pH>色譜柱類型>離子對試劑（但是，如果包括更多樣化的離子對試劑，如HFBA、ClO4和PF6），那么離子對試劑的重要性就會增大）。

在分析含有合成相關雜質的牛GLP-2（1-15）樣品時，流動相提供了不同選擇性。具有高離子強度的流動相被證明對于產生對稱峰至關重要。比較C18色譜柱和另外三種固定相（即烷基酰胺、氟苯基和聯苯），這些固定相先前已被證明在有限的流動相子集上對這些肽具有較大的選擇性差異。除離子對試劑BuSO3Na外，C18、氟苯基和聯苯相的趨勢相似，表明這些發現適用于絕大多數適用于肽分析的RPC色譜柱（即中性或弱極性）。這些結論與具有更不同性質（即含有高度正電荷）的色譜柱無關。

這項工作的結果與固定相表征研究[29]相結合，有望有助于定義RPC肽分離的方法開發策略。本文旨在為分析人員提供流動相相似性/差異性的快速簡約可視化，以便進行方法開發選擇，并不打算說明哪種流動相組成是最佳的，因為這將是特定肽應用所獨有的，分析人員有責任發現和驗證用于特定肽分離的最佳流動相添加劑。

反相色譜肽分離色譜柱和流動相研究

編譯結語

看到本結語，可能您已經有所收獲。無論您是否從事肽的有關物質方法開發或者只關注小分子的研究，通讀或者完全讀懂這四篇文章都會帶來不少的幫助。這四篇文章中有非常豐富的化學結構和性質相關知識，色譜柱化學知識，統計學知識，耐用性研究策略等等。無論您獲得多與少，總之，恭喜您完成了四萬多字的閱讀。

以下是我們ACD/Labs能夠為從事肽類物質研究的色譜工作者提供的工具：

本系列文章中提到的肽反相色譜柱表征庫以及小分子適用的Tanaka或者Tanaka 拓展色譜柱數據庫在AutoChrom內皆可查詢。

圖1 Tanaka 色譜柱數據庫

圖2 拓展Tanaka 色譜柱數據庫

圖3 肽反相色譜柱表征數據庫

除此之外，AutoChrom內還含有靜電荷計算軟件，位于Percetpa pKa模塊內。

圖4 Percepta pKa 靜電荷計算器

Chemsketch 內含有緩沖鹽計算器，可計算pH,離子強度和緩沖容量

圖5 pH Calculator 界面計算緩沖體系

LC-Simulator 內可對影響因素進行單因素或者多因素建模

圖5 蛋白質梯度建模保留時間模擬公式

圖6 蛋白質梯度溫度兩因素建模保留時間模擬公式

Lc-Simulator三因素響應面揭示可操作范圍

圖7 三因素響應面模型展示

?

如果您想做更多的溝通和聯絡，請與我們取得聯系。有很多科學工作我們可以一起探討和協作。

請聯絡：

zuowei.yan@acdlabs.com

13816084932

參考文獻：

向上滑動閱覽

[1] D.C. Guo, C.T. Mant, R.S. Hodges, Effects of ion-pairing reagents on the prediction of peptide retention in reveresed-phase high performance liquid chromatography, J. Chromatogr. 386 (1987) 205–222.

[2] Y. Chen, A.R. Mehok, C.T. Mant, R.S. Hodges, Optimum concentration of trifluoroacetic acid for reversed-phase liquid chromatography of peptides revisited, J. Chromatogr. A. 1043 (2004) 9–18.

[3] M. Shibue, C.T. Mant, R.S. Hodges, The perchlorate anion is more effective than the trifluoroacetate anion as an ion-pairing reagent for reversed-phase chromatography of peptides, J. Chromatogr. A. 1080 (2005) 49–57.

[4] M. Shibue, C.T. Mant, R.S. Hodges, Effect of anionic ion-pairing reagent hydrophobicity on selectivity of peptide separations by reversed-phase liquid chromatography, J. Chromatogr. A. 1080 (2005) 68–75.

?[5] M. Shibue, C.T. Mant, R.S. Hodges, Effect of anionic ion-pairing reagent concentration (1-60 mM) on reversed-phase liquid chromatography elution behaviour of peptides, J. Chromatogr. A. 1080 (2005) 58–67.

[6] M. Gilar, H. Xie, A. Jaworski, Utility of retention prediction model for investigation of peptide separation selectivity in reversed-phase liquid chromatography: Impact of concentration of trifluoroacetic acid, column temperature, gradient slope and type of stationary phase, Anal. Chem. 82 (2010) 265–275.

[7] Y. Chen, C.T. Mant, R.S. Hodges, Selectivity differences in the separation of amphipathic alpha-helical peptides during reversed-phase liquid chromatography at pHs 2.0 and 7.0: effects of different packings, mobile phase conditions and temperature, J. Chromatogr. A. 1043 (2004) 99–111.

[8] C.T. Mant, A. Byars, S. Ankarlo, Z. Jiang, R.S. Hodges, Separation of highly charged (+5 to +10) amphipathic α-helical peptide standards by cation-exchange and reversed-phase high performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A. 1574 (2018) 60–70.

[9] C.T. Mant, D. Cepeniene, R.S. Hodges, Reversed-phase HPLC of peptides: Assessing column and solvent selectivity on standard polar-embedded and polar endcapped columns, J. Sep. Sci 33 (2010) 3005–3021.

[10] H. Liu, B. Xu, M.K. Ray, Z. Shahrokh, Peptide mapping with liquid chromatoraphy using a basic mobile phase, J. Chromatogr. A. 1210 (2008) 76–83.

[11] C.T. Mant, Y. Chen, R.S. Hodges, Temperature profiling of polypeptides in reversed-phase liquid chromatography I. Monitoring of dimerization and unfolding of amphipathic alpha-helical peptides, J. Chromatogr. A. 1009 (2003) 29–43.

[12] C.T. Mant, B. Tripet, R.S. Hodges, Temperature profiling of polypeptides in reversed-phase liquid chromatography II. Monitorying of folding and stability of two stranded alpha-helical coiled-coils, J. Chromatogr. A. 1009 (2003) 45–59.

[13] Y. Chen, C.T. Mant, R.S. Hodges, Temperature selectivity effects in reversed-phase liquid chromatography due to conformation differences between helical and non-helical peptides, J. Chromatogr. A. 1010 (2003) 45–61.

[14] C.T. Mant, R.S. Hodges, Context dependent effects on the hydrophilicity /hydrophobicity of side-chains during reversed-phase high performance liquid chromatography: Implications for prediction of peptide retention behaviour, J. Chromatogr. A. 1125 (2006) 211–219.

[15] J.M. Kovacs, C.T. Mant, R.S. Hodges, Determination of intrinsic hydrophilicity /hydrophobicity of amino acid side chains in peptides in the absence of nearest-neighbour or conformation effects, Biopolymers (Pept. Sci.) 84 (2006) 283–297.

[16] B. Tripet, D. Capeniene, J.M. Kovacs, C.T. Mant, O.V. Krokhin, R.S. Hodges, Requirements for prediction of peptide retention time in reversed-phase high performance liquid chromatography: Hydrophilicity /hydrophobicity of side-chains at the N- and C-termini of peptides are dramatically affected by the end groups and location, J. Chromatogr. A. 1141 (2007) 212–225.

[17] C.T. Mant, J.M. Kovacs, H.M. Kim, D.D. Pollock, R.S. Hodges, Intrinsic amino acid side chain hydrophilicity /hydrophobicity coefficients determined by reversed-phase high performance liquid chromatography of model peptide: Comparison with other hydrophilicity / hydrophobicity scales, Pept. Sci. 92 (2009) 573–595.

[18] C.T. Mant, R.S. Hodges, Design of peptide standards with the same composition and minimal sequence variation to monitor performance /selectivity of reversed-phase matrices, J. Chromatogr. A. 1230 (2012) 30–40.

[19] M. Gilar, A. Jaworski, T.S. Mcdonald, Solvent selectivity and strength in reversed-phase liquid chromatography separation of peptides, J. Chromatogr. A. (2014) 1337.

[20] M. Gilar, A. Jaworski, Retention behaviour of peptides in hydrophilic interaction chromatography, J. Chromatogr. A. 1218 (2011) 8890–8896.

[21] V. Spicer, A. Yamchuk, J. Cortens, S. Sousa, W. Ens, K.G. Standing, J.A. Wilkins, O.V. Krokhin, Sequence specific retention calculator. A family of peptide retention time prediction algorithms in reversed-phase HPLC: Applicability to various chromatographic conditions and columns, Anal. Chem. 79 (2007) 8762–8768.

[22] O.V. Krokhin, Peptide retention prediction in reversed-phase chromatography: Proteomic applications, Expert. Rev. Proteomics 9 (2012) 1–4.

?[23] A.N. Hodder, M.I. Aguilar, M.T. Hearn, High performance liquid chromatography of amino acids, peptides and proteins. LXXXIX. The influence of different displacer salts on the retention properties of proteins separated by gradient anion-exchange chromatography, J. Chromatogr. 476 (1989) 391–411.

[24] A.W. Purcell, G.L. Zhao, M.I. Aguilar, M.T.W. Hearn, Comparison between the isocratic and gradient retention behaviour of polypeptides in reversed-phase liquid chromatographic environments, J. Chromatogr. A. 852 (1999) 43–57.

[25] R.I. Boysen, A.J.O. Jong, M.T.W. Hearn, Binding behaviour and conformational properties of globular proteins in the presence of immobilised non-polar ligands used in reversed-phase liquid chromatography, J. Chromatogr. A. 1079 (2005) 173–186.

[26] R.I. Boysen and M.T.W. Hearn, High-Performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins, in Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry: Analysis and Function of Amino Acids and Peptides, A.B. Hughes, Editor. 2011, Wiley: Chichester. p. 167-210.

[27] J.K. Field, M.R. Euerby, P. Petersson, J. Lau, H. Th?gersen, Investigation into reversed-phase chromatography peptide separation systems part I: Development of a protocol for column characterisation, J. Chromatogr. A. 1603 (2019) 113–129.

[28] J.K. Field, M.R. Euerby, P. Petersson, Investigation into reversed-phase chromatography peptide separation systems Part II: An evaluation of the robustness of a protocol for column characterisation, J. Chromatogr. A. 1603 (2019) 102–112.

[29] J.K. Field, M.R. Euerby, P. Petersson, Investigation into reversed phase chromatography peptide separation systems part III: Establishing a column characterisation database, J. Chromatogr. A. (2020) 1622.

?[30] D.V. McCalley, Effect of mobile phase additives on solute retention at low aqueous pH in hydrophilic interaction liquid chromatography, J. Chromatogr. A., 1483 (2017) 71–79.

[31] D.V. McCalley, D. Guillarme, Evaluation of additives on reversed-phase chromatography of monoclonal antibodies using a 1000 A stationary phase, J. Chromatogr. A. (2020) 1610. [32] P. Petersson, B.O. Boateng, J.K. Field, M.R. Euerby, A practical approach to modelling of reversed-phase liquid chromatographic separations: Advantages, principles and possible pitfalls, LCGC Europe 31 (2018) 120–143.

[33] I.A. Haidar Ahmed, W. Chen, H.M. Halsey, A. Klapars, J. Limanto, G.F. Pirrone, T. Nowak, R. Bennett, R. Hartman, A.A. Makarov, I. Mangion, E.L. Regalado, Multi-column ultra-high performance liquid chromatography screening with chaotropic agents and computer-assisted separation modeling enables process development of new drug substances, Analyst 144 (2019) 2872–2880.

[34] F. Hofmeister, Instructions on the effects of mineral salts: Mechanisms of protein precipitation by mineral salts and their role in protein function, Arch. Exp. Pathol. Pharmacol. 24 (1888) 247–260.

[35] H. Jakubowski. Hofmeister Series. 2006 (Accessed 22nd December 2020)]; Available from: https://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/ protstructure/hofmeister.gif.

[36] B. Lajin, W. Goessler, Fluorinated carboxylic acids as "ion repelling agents" in revered-phase chromatography, J. Chromatogr. A. (2020) 1631.

[37] D.V. McCalley, Study of retention and peak shape in hydrophilic interactions chromatography over a wide pH range, J. Chromatogr. A. 1411 (2015) 41–49.

[38] M.C. García, The effect of the mobile phase additives on sensitivity in the analysis of peptides and proteins by high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry, J. Chromatogr. B. 825 (2005) 111–123.

[39] A. Apffel, S. Fischer, G. Goldberg, P.C. Goodley, F.E. Kuhlmann, Enhanced sensitivity for peptide mapping with electrospray liquid chromatography-mass spectrometry in the presence of signal suppression due to trifluoroacetic acid containing mobile phases, J. Chromatogr. A. 712 (1995) 177–190.

?[40] X. Wang, S. Yang, Y. Li, J. Zhang, Y. Jin, W. Zhao, Y. Zhang, J. Huang, P. Wang, C. Wu, J. Zhou, Optimisation and application of parallel solid-phase extraction coupled with ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of 11 aminoglycoside residues in honey and royal jelly, J. Chromatogr. A. 1542 (2018) 28–36.

[41] M.C. Garcia-Alvarez-Coque, G. Ramis-Ramos, M.J. Ruiz-Angel, et al., Atomic Absorption Spectrometry - Electrothermal, in: P. Worsfold, et al. (Eds.), Encyclopedia of Analytical Science, Editors., Elsevier, 2016, pp. 117–126.

[42] , The 0.1% TFA revolution - A sign of chromatographic laziness?, in: The Column, LCGC, 13, 2017, pp. 11–13.

[43] W.H. Tuminello, G.T. Dee, Thermodynamics of poly(tetrafluoroethylene) solubility, Macromolecules 27 (1994) 669–676.

[44] B. Gaur, H.S. Srinivasan, Corrosion of metals and alloys in methane sulphonic acid, British Corrosion Journal 34 (1999) 63–68.

[45] M. Fin?gar, I. Milo?ev, Corrosion behaviour of stainless steels in aqueous solutions of methanesulfonic acid, Corrosion Science 52 (2010) 2430–2438.

?[46] M. Fin?gar, J. Jackson, Electrochemical study of AISI C1018 steel in methanesulfonic acid containing an acetylenic alcohol-based corrosion inhibitor formulation, J. Lab. Automation 21 (2016) 632–641.

[47] A.M. Hyde, S.L. Zultanski, J.H. Waldman, Y. Zhong, M. Shevlin, F. Peng, General principles and strategies for salting-out informed by the Hofmeister series, Org. Process Res. Dev. 21 (2017) 1355–1370.

[48] M. Chaplin. Kosmotropes and Chaotropes. 2019 (Accessed 18th September 2019)]; Available from: http://www1.lsbu.ac.uk/water/kosmotropes_ chaotropes.html.

[49] P. Ball, J.E. Hallsworth, Water structure and chaotropicity: their uses, abuses and biological implications, Phys. Chem. Chem. Phys. 17 (2015) 8297–8305.

[50] A. Makarov, R. LoBrutto, Y. Kazakevich, Liophilic mobile phase additives in reversed phase HPLC, J. Liquid Chromatogr. & Rel. Tech. 31 (2008) 1533–1567.

[51] R. LoBrutto, A. Jones, Y.V. Kazakevich, H.M. McNair, Effect of the eluent pH and acidic modifiers in high-performance liquid chromatography retention of basic analytes, J. Chromatogr. A. 913 (2001) 173–187.

[52] J. Flieger, The effect of chaotropic mobile phase additives on the separation of selected alkaloids in reversed-phase high-performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A. 1113 (2006) 37–44.

[53] L. Terborg, S. Nowak, S. Passerini, M. Winter, U. Karst, P.R. Haddad, P.N. Nesterenko, Ion chromatographic determination of hydrolysis products of hexafluorophosphate salts in aqeuous solution, Anal. Chim. Acta 714 (2012) 121–126.

[54] D.V. McCalley, Study of overloading of basic drugs and peptides in reversed-phase high performance liquid chromatography using pH adjustment of weak acid mobile phases suitable for mass spectrometry, J. Chromatogr. A. 1075 (2005) 57–64.

[55] D. Johnson, B. Boyes, R. Orlando, The use of ammonium formate as a mobile phase modifier for LC-MS/MS analysis of tryptic digests, J. Biomol. Tech. 24 (2013) 287–297.

[56] B. Bobály, A. Beck, J. Fekete, D. Guillarme, S. Fekete, Systematic evaluation of mobile phase additives for the LC-MS characterisation of therapeutic proteins, Talanta 136 (2015) 60–67.

[57] D.V. McCalley, Effect of buffer on peak shape of peptides in reversed-phase high performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A. 1038 (2004) 77–84.

[58] J.W. Dolan, Ion pairing - Blessing or curse? LCGC North America 26 (2008) 170–174.

[59] A. Vailaya, C. Horvath, Retention in reversed-phase chromatography: partition or adsorption, J. Chromatogr. A. 829 (1998) 1–27.

[60] L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.W. Dolan, Chapter 7.4, in: Ion-Pair Chromatography (IPC), in Introduction to modern liquid chromatography, Wiley & Sons, New Jersey, 2010, pp. 331–347.

[61] A.L.L. Duchateau, B.H.M. Munsters, G.T.C. Kwakkenbos, R.G.J.V. Leuken, Selection of buffers and of an ion-pairing agent for thermospray liquid chromatographic-mass spectrometric analysis of ionic compounds, J. Chromatogr. 552 (1991) 605–612.

[62] J. Nguyen, J. Smith, O.V. Friese, J.C. Rouse, D.P. Walsh, X. Zhang, N. Ranbaduge, M.A. Lauber, A new LC-MS approach for enhancing subunit-level profiling of mABs and ADCs, ASMS, San Diego, CA, 2018.

[63] J.M. Nguyen, J. Smith, S. Rzewuski, M.A.L.C. Legido-Quigley, High sensitivity LC-MS profiling of antibody-drug conjugates with difluoroacetic acid ion pairing, MAbs 11 (2019) 1358–136

本篇文章為反相色譜肽分離系統研究第四部分，本研究共有四個部分，現已全部發布在ACD/Labs微信公眾號。

前期回顧：

1. 反相色譜肽分離系統研究第一部分：開發色譜柱表征方案

2.?反相色譜肽分離系統研究 第二部分：色譜柱表征方案的耐用性評估

3.?反相色譜多肽分離系統研究第三部分：建立色譜柱表征數據庫

ACD/Labs CN

微信號｜ACDLabsCN