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淺談反相Flash色譜和正相分離的區(qū)別
反相快速純化色譜以較低的成本和對(duì)環(huán)境的影響，實(shí)現(xiàn)了樣品的高效分離純化，影響了整個(gè)化學(xué)工業(yè)。反相Flash色譜在最近的十幾年時(shí)間里形成了巨大的應(yīng)用飛躍，但是，由于缺乏信息和數(shù)據(jù)的支持，化學(xué)家在很多情況下，都是靠經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行純化工作。
極性化合物、水溶性化合物得到了很多藥物和天然產(chǎn)物研發(fā)機(jī)構(gòu)的重視，這些分子是組成生物體的重要化合物。傳統(tǒng)方法是用HPLC(高效液相色譜法)純化制備此類化合物，但是成本較高。對(duì)于每天都要進(jìn)行大量純化工作的化學(xué)家來說，使用預(yù)裝的反相快速純化色譜柱是一種非常好的選擇，可以處理各類極性化合物。
反相快速制備色譜不同于正相色譜，主要表現(xiàn)在三方面：
1) 固定相
2) 流動(dòng)相
3) 適用的樣品類型
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固定相
正相硅膠具有極性基的表面；而反相硅膠是經(jīng)過改性，表面鍵合烷基鏈（例如 C-18）,它的極性更小，因此，它對(duì)極性化合物有較小的保留。
經(jīng)典的反相硅膠表面的圖示。C-18的烷基鏈鍵合在硅膠表面，增加了硅膠的疏水性。
然而，由于長(zhǎng)時(shí)間正相硅膠的強(qiáng)大的極性作用，經(jīng)常會(huì)和樣品形成死吸附，影響分離效果，科學(xué)家在硅膠是基礎(chǔ)上進(jìn)行了修飾，將C碳鏈連接到硅膠的羥基上使其極性降低，具有了脂溶性的特質(zhì)，同時(shí)由于固定相基質(zhì)的變化，之前在正相當(dāng)中所使用的的溶劑變得不可用，需要使用水相和有機(jī)相混合體系進(jìn)行洗脫，由于各類化合物在水相和有機(jī)相之間都有相應(yīng)的分配系數(shù)，樣品的分配系數(shù)不同，洗脫下來的速度就會(huì)形成差異，最終達(dá)到分離的目的。
目前市面上的反相Flash 固定相填料主要為C18，也有少部分的C4，C8等，如Bioatge 推出的專門針對(duì)于多肽大分子分離的多肽分子純化色譜柱。
流動(dòng)相
正相色譜，因?yàn)楣枘z表面的硅羥基極性大，極性大的水溶性化合物很難被洗脫下來，只有使用更強(qiáng)極性的溶劑才能成功。因此在正相體系中，所使用的流動(dòng)相都是極性比硅膠更大的溶劑，通過更大極性的溶劑將樣品系統(tǒng)下來，從色譜原理的角度，這種通過極性大小，分子將吸附的相互作用的分離方式，我們稱之為正相洗脫分離方式。
正相色譜，因?yàn)楣枘z表面的硅羥基極性大，極性大的水溶性化合物很難被洗脫下來，只有使用更強(qiáng)極性的溶劑才能成功。在正相色譜條件下，可供選擇的溶劑很少，因此，對(duì)極性大的水溶性化合物，很難得到足夠純度的產(chǎn)品。
然而，在反相色譜中，因?yàn)椋瑯O性化合物和固定相的吸附性較小，因此用較小極性的溶劑，就可以實(shí)現(xiàn)比較理想的洗脫效果。所以，在實(shí)踐中，反相色譜可以提供更好的分離方法。固定相變化之后，其流動(dòng)相也需要隨之改變，反相的流動(dòng)相往往是通過水相和有機(jī)相兩種溶劑的混合，例如：水和甲醇、水和乙腈等，通過在水和有機(jī)相之間的分配系數(shù)的不同從而達(dá)到分離的目的。
適用的樣品類型：
由于反相條件下，修飾了硅膠表面的羥基，使其極性降低，使得其適用性變得更加寬廣（相對(duì)比反相而言），各類極性的大小分子，天然產(chǎn)物，都可以在反相體系中得到有效分離。我們羅列了根據(jù)各類分子結(jié)構(gòu)而可支持的不同色譜柱類型，可以發(fā)現(xiàn)反相的應(yīng)用范圍更寬廣和多元化。
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此外，上表中還有另外一種色譜柱類型：氨基色譜柱；這也是其中官能團(tuán)化之后的色譜柱，其就是用氨基代替了傳統(tǒng)的羥基，使整個(gè)色譜柱具有堿性，而非傳統(tǒng)的酸性，此類類型的色譜柱適用于各種堿性化合物的分離，如各類生物堿等。代替各類需要加入三乙胺進(jìn)行pH調(diào)節(jié)的正相分離體系，簡(jiǎn)化分離步驟，提高分離效率。
