TaqTalk第24期 | microRNA定量數(shù)據(jù)歸一化方法

賽默飛基因科學(xué)中國

2023.10.12

您知道內(nèi)源性對(duì)照品、外源性對(duì)照品和平均表達(dá)值有何意義嗎？您猜對(duì)了，本期TaqTalk將為您解答有關(guān)microRNA定量數(shù)據(jù)歸一化方法的問題。

microRNA或miRNA是小的非編碼RNA片段，長度大約為22個(gè)堿基對(duì)，用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)。microRNA能夠通過Applied Biosystems TaqMan檢測(cè)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR定量分析。在microRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，起始材料的數(shù)量、樣本收集、RNA制備、RNA質(zhì)量和反轉(zhuǎn)錄效率的變化都可能導(dǎo)致定量誤差。因此，在定量分析microRNA時(shí)必須使用合適的歸一對(duì)照品。那么，讓我們來了解一下“taq-nical”

qPCR microRNA分析有三種常用的歸一法。您可以使用內(nèi)源性對(duì)照品、外源性對(duì)照品或平均表達(dá)值歸一化，也稱為全局均值歸一化。

內(nèi)源性對(duì)照歸一法

目前，使用內(nèi)源性對(duì)照基因的歸一化是糾正RNA輸入潛在差異或反轉(zhuǎn)錄(RT)效率偏差的最準(zhǔn)確方法。

理想的內(nèi)源性對(duì)照基因在各種組織、細(xì)胞類型和治療方法中，具有相對(duì)一致和適度豐富的表達(dá)。表達(dá)一致的microRNA可以用作內(nèi)源性對(duì)照品。已證實(shí)部分microRNA在許多不同的組織類型中以相對(duì)恒定的水平進(jìn)行表達(dá)，它們可能與內(nèi)源性對(duì)照品一樣適用于分析。但請(qǐng)注意，任何單一對(duì)照品均不能作為適用于所有實(shí)驗(yàn)條件的通用對(duì)照品。因此，我們建議，針對(duì)每種細(xì)胞類型、組織或治療方法，驗(yàn)證兩個(gè)或更多microRNA作為內(nèi)源性對(duì)照品。

外源性對(duì)照歸一法

外源性對(duì)照品或加標(biāo)對(duì)照品是合成的microRNA，將其添加到樣本中以監(jiān)測(cè)復(fù)雜樣本的提取效率或樣本輸入，如血漿、血清和其他生物流體。加標(biāo)對(duì)照品應(yīng)為一個(gè)靶序列，不存在于樣本中。例如，人類中未檢測(cè)到ath-miR159A，因此ath-miR159A是人類樣本的良好外源性對(duì)照品。

全局均值歸一法

大規(guī)模的microRNA表達(dá)譜研究可以使用全局均值歸一化，使用指定樣本中所有microRNA的計(jì)算均值作為歸一標(biāo)準(zhǔn)值。

最后，讓我們快速回顧一下這三種不同的歸一法：使用外源性對(duì)照品，使用內(nèi)源性對(duì)照品和平均表達(dá)值歸一化。在使用qPCR分析microRNA時(shí)，您可以利用這些歸一法控制實(shí)驗(yàn)過程的某些方面。

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TaqMan Assay產(chǎn)品包括靶標(biāo)特異性引物和一個(gè)或多個(gè)探針，使用通用的反應(yīng)程序，保障最優(yōu)的擴(kuò)增效率和檢測(cè)表現(xiàn)