分享至
【案例分享】解析電噴霧電離質譜成像(DESI-MSI)在環境暴露的研究進展
作為苯二氮卓類藥物的代表藥物，地西泮(DZP)起到鎮靜安眠的作用，在臨床上廣泛用于焦慮癥和抑郁癥的治療。然而，DZP也常被非法作為動物抗應激藥物使用，甚至非法添加到鎮靜保健品中，嚴重威脅動物源性食品衛生安全和人類健康。大量使用的DZP通過各種途徑排放進入環境中導致水體環境污染普遍存在。文獻報道水體環境中存在地西泮的5種氯化消毒副產物，因此需要深入探討DZP氯消毒副產物的分布和毒性調控機制，為生態風險和人群健康提供依據。
北京市疾控預防控制中心邵兵研究員團隊和中國農大動物醫學院合作在《Talanta》發表了《Distribution visualization of the chlorinated disinfection byproduct of diazepam in zebrafish with desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging》，又在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上發表了題為《Chlorine disinfection byproduct of diazepam affects nervous system function and possesses gender-related difference in zebrafish》的研究論文。兩篇文章通過解析電噴霧電離質譜成像，直觀高效地分析了地西泮氯化消毒副產物中的2-甲胺基-5-氯二苯甲酮(MACB)在斑馬魚體內的分布及其代謝產物，同時利用主成份分析和偏最小二乘法對數據進行深度分析，探討了MACB對斑馬魚的神經毒性影響和性別差異。
實驗方法
01
樣品制備
4月齡的斑馬魚暴露于濃度為1 μg/L MACB中，分別于暴露后24h、48h、72h、96h利用麻醉劑安樂死，然后包埋于盛有5%羧甲基纖維素的錫紙盒中，立刻保存于-80 ℃冰箱。利用冷凍切片機將斑馬魚切成厚度為50 μm貼于載破片上，進行DESI-MSI分析。
02
DESI實驗條件
采用配備有DESI源的Waters Xevo G2-XS QTof 質譜儀進行成像實驗。?
DESI參數：霧化氣體（氮氣）
壓力：0.45 MPa
噴霧溶劑：80% MeOH、20% H2O（含0.1%甲酸和0.1 mM亮氨酸腦啡肽），流速為3 μL/min
毛細管電壓：4.5 kV
電離方式：正離子模式，掃描質量范圍m/z 100 - 1,000，像素大小為200 μm，掃描速率400 μm/s 。
實驗結果
01
DESI定量的探討
分別將5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、125 μg/mL、500 μg/mlL取1 μL輕輕點在沒有MACB暴露下斑馬魚切片的背側區，置于室溫晾干，用DESI-QTOF分析。
圖1. MACB在斑馬魚脊背側區部分建立額標準曲線。
02
利用DESI獲得MACB在斑馬魚體內的分布
DESI-MS成像結果顯示，MACB通過血腦屏障進入斑馬魚的腦部位。雌性斑馬魚暴露MACB 24h后，MACB分布于斑馬魚全身，隨著時間推移，MACB在斑馬魚體內的含量逐漸降低，但是在雄性體內MACB的分布趨勢與雌性斑馬魚相反，存在明顯性別差異。
圖2. 不同時間點暴露下MACB在雌性、雄性斑馬魚體內分布。
另外，MACB可在斑馬魚不同組織中積累，根據前面建立的標準曲線（范圍是5 μg/mL - 500 μg/mL）,斑馬魚體內的MACB濃度在5.22 - 174.22 μg/mL，DESI質譜成像可用于測定MACB在斑馬魚體內的分布和半定量，以上結果表明利用DESI-MS成像技術可以很好地探索目標化合物在生物體內的分布。
03
利用DESI-MS獲得MACB在斑馬魚體內的代謝物
同時通過DESI-MS成像分析，發現質荷比m/z 230.0818的物質在斑馬魚體內的時空分布趨勢與母體化合物MACB一致，這表明m/z 230.0818是MACB的代謝物質。MACB的代謝物在雌性斑馬魚分布趨勢與雄性斑馬魚相反，也存在明顯的性別差異。
圖3. MACB的代謝物m/z 230.0833在斑馬魚體內的分布。
04
利用DESI-MSMS對MACB的代謝物m/z 230.0833進行定性分析
DESI是一種相對無損的分析技術，在同一個切片上先進行DESI-MS分析，再進行DESI-MSMS分析。文章分別對MACB和m/z 230.0833進行二級質譜圖成像分析，根據母離子和子離子的精確質量數，可以推斷代謝物m/z 230.0833的結構為MACB脫甲基成環。
圖4. MACB 在斑馬魚切片上的二級質譜圖。
圖5 . MACB的代謝物在斑馬魚切片上的二級質譜圖。
（上下滑動查看更多）
05
利用DESI進行空間組學分析來解釋MACB的神經毒性和性別差異
為探討MACB對斑馬魚體的神經毒性和性別差異，將斑馬魚脊髓的物質進行PCA分析，發現MACB暴露后體內物質具有組間差異。同時通過OPLS-DA對72h和空白對照組進行分析，m/z 104.1079、m/z 118.0870、m/z 132.0778等內源性物質具有顯著性差異，分別是膽堿、纈氨酸、肌酸。同時為了驗證MACB是否干擾體內氨基酸的穩態，又用了傳統的高效液相色譜法檢測斑馬魚體內的氨基酸含量。
圖6. MACB暴露0h、24h、48h、72h斑馬魚脊髓部位的PCA圖。
圖7. MACB暴露0h、72h斑馬魚脊髓部位的S-Plot圖。
（上下滑動查看更多）
小結
DESI-MSI在環境暴露組學和環境毒理的應用證明了其強大的功能和實用性。本研究通用DESI-MSI技術探究了地西泮的消毒副產物MACB在斑馬魚體內的分布和代謝。利用DESI-MSI得到MACB及其代謝物在斑馬魚的分布，并且通過DESI-MSMS對新的代謝物進行定性分析。通過DESI-MSI進行空間組學分析，對MACB對神經系統影響和性別差異進行深度分析。
