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轉載：硬核科普 | 敞開式電離質譜（API-MS）的臨床檢測應用
醫學檢驗診斷是現代醫學不可分割的重要組成部分，隨著現代醫學的發展，迫切需要提升檢驗手段的準確性和快速性來促進臨床決策。過去五十年里，分析方法和技術的不斷發展對疾病的檢測和治療產生了巨大的影響。
大多數體外診斷借助免疫分析來檢測目標分析物，但這種方法的一些局限性(交叉反應性、低靈敏度、有限的動態范圍，以及通常昂貴和耗時的處理)使研究者不斷尋求更好的、具有高敏感性和特異性、并能提供高吞吐量解決方案與替代方法。
隨著技術的發展，目前質譜(MS)在診斷分子病理學方面的靈敏度已經達到飛摩爾級，優于傳統的化學/生化測量方法。自J. J.湯姆森首次發明以來，在一百多年的時間里，質譜技術隨著新的離子源設計、分辨率和靈敏度的提高以及小型化而不斷發展，已成為分析化學、生物學中一種功能強大、應用范圍廣泛的技術。
在大多數質譜分析中，樣品在引入質譜儀之前通常要經過提純和分離等程序。在過去的幾十年里，人們努力提高生物樣品和復雜混合物的檢測靈敏度。像液相色相法這樣的分離程序即是為此目的而設計的。但是，這些分離過程需要耗費大量的時間和資源，在高通量的分析環境中，例如每天1000個臨床樣本，氣相色譜(GC)和液相色譜(LC)就變得不切實際。
近十幾年來，一種被稱為敞開式電離質譜(Ambient ionization mass spectrometry，AIMS)（小編注：國際通用名詞是Ambient pressure ionization mass spectrometry, API-MS）的替代策略被開發出來，旨在以低得多的成本進行MS快速檢測。
AIMS可以直接應用于活體器官、皮膚、組織、生物液體和揮發物，并對空氣開放(環境條件)，幫助瞬時捕獲來自這些樣本的分子指紋。本文將簡單介紹幾種應用廣泛的AIMS方法，并介紹研究者在臨床檢測方面的應用場景。
電噴霧解吸電離質譜
電噴霧解吸電離質譜（Desorption electrospray ionization mass spectrometry，DESI-MS）是在氮氣流的氣動輔助下，使用一束高速帶電微液滴撞擊樣品(例如組織)表面，將樣品中的分子提取并轉移到飛濺的微液滴中，隨后這些微液滴轉變為帶電氣相微粒供質譜檢測。DESI-MS的質譜性質與電噴霧電離(ESI)相似，但其機理尚不完全清楚。DESI-MS實驗可以在幾秒鐘內完成，只需少量或不需要樣品制備。（小編注：普渡大學Cooks教授課題組推出的DESI以及后續一些其他基于電噴霧原理的API電離源可以說是引領了這個領域的發展。中國科學院大學黃光明教授課題組對DESI進行改良的MEMI技術進一步提高了該類技術的靈敏度和可覆蓋物質種類。）
DESI-MS的特點
DESI-MS的這些特性實現了各種樣品的高通量分析，如活檢標本、藥物制劑(片劑、藥膏等)和濾紙上的生物液體斑點。DESI-MS能夠同時檢測數百種代謝生物標志物，這種方法比簡單地評估一個或幾個候選生物標志物具有更強的定性能力。快速、多功能性、無需復雜的樣品制備以及在環境條件下操作，使得DESI-MS非常具有作為一種快速診斷工具的前景。DESI-MS還可以通過在x和y方向掃描組織表面進行二維操作，從而對組織進行詳細的生化(脂質、代謝物等)成像，可以同時可視化生物組織中數百種代謝物、脂質和其他小分子的分布。這種無標記物分子成像技術在快速評估活檢標本方面的顯著成功有望將DESI-MS作為下一代組織病理學技術。
DESI-MS的應用
DESI-MS的臨床應用干血斑(Dried Blood Spot，DBS)檢測是一種常用的采樣和儲存方式，其擁有方便、攜帶樣本量小等優勢。例如，DESI-MS已成功應用于DBS中對西他喹、特非那定和哌唑嗪等藥物水平的良好定量評價。反應性DESI是DESI-MS的一種變體，在臨床應用中很有用。試劑被用來與分析物中的特定類別的化合物發生反應，形成鍵或加合物。反應性DESI的最大優點是可以檢測到傳統ESI-MS中難以電離的分子。試劑對目標物的特異反應性有助于大大提高目標化合物的選擇性和靈敏度。關于使用DESI-MS來鑒別癌變組織的工作已經報道了很多，包括乳腺癌、前列腺癌、腦癌。這些工作大多集中在脂質組成的變化剖面上，以對癌變部分進行分類。
萃取電噴霧電離質譜
萃取電噴霧電離質譜（Extractive electrospray ionization mass spectrometry ，EESI-MS)通過兩股氣溶膠流的融合進行工作。EESI有一個獨特的設計，利用兩個噴霧器，并沿一定的角度對準質譜儀，第一個通道是產生一次離子的ESI通道，另一個通道是樣品注入通道(不施加電壓)，樣品由一次離子羽流霧化。該設計是EESI能夠容忍復雜樣品基質的關鍵，能夠在最少預處理的情況下直接分析生物樣品。樣本(尿液、血清)被霧化成氣溶膠滴，在電噴霧(ES)滴的轟擊下，通過液-液萃取產生聚合。通過ES過程的后續液滴演化產生氣態帶電分析物，用于質譜檢測。（小編注：EESI的原創工作是陳煥文老師在普渡大學和蘇黎世聯邦理工期間完成。EESI可以分析純VOCs樣品，也可以分析純氣溶膠樣品，當然混合樣品也可。對于混合樣品，比如環境大氣，可以通過采用denunder或HEPA filter來達到分析純氣溶膠或純VOCs的效果。‘萃取’一詞也意味著氣態/氣溶膠樣品跟一次離子羽流的碰撞、萃取、去溶劑效率跟總體的檢測效果息息相關。）
EESI的特點
研究證明，使用EESI-MS對活體物體(如皮膚)進行快速分析在臨床診斷和國土安全方面具有潛在應用。微酸化甲醇/水溶液混合物可用于ESI通道以進行正離子模式EESI實驗，堿性甲醇/水溶液則用于負離子模式。電離后的帶電的分析物通過離子光學系統采樣進入質譜分析儀進行進一步的質譜分析。呼吸氣分析是一種非侵入性的方法，通過監測呼出氣體中的化合物來獲取個人的臨床狀態信息。對許多司機來說，一個眾所周知的例子是血液酒精測試。1971年，諾貝爾獎得主萊納斯·鮑林(Linus Pauling)證明，人類呼吸是一種復雜的氣體，包含200多種不同的揮發性有機化合物(VOCs)。EESI-MS通過對呼吸氣樣品中揮發性和非揮發性化合物的指紋識別，為人體代謝動力學檢測提供了一種方便的方法。在沒有修改設計的情況下，研究者將EESI耦合到Q-TOF質譜儀上，在無樣品制備的情況下檢測人體呼吸氣。他們從呼吸氣樣本中檢測到與人體代謝動力學相關的化合物，例如，一夜禁食后尿素水平較高，吃奶酪2小時后尿素水平較低。（小編注：衍生閱讀?https://doi.org/10.1002/anie.200602942）
EESI的應用
通過直接分析呼吸氣樣本，EESI在個性化醫療和藥物開發方面具有很大的潛力。丙戊酸(VPA)因其對y-氨基丁酸通路和鈉/鈣通道的調節作用，長期以來被用于治療癲癇和其他神經精神障礙。研究者利用EESI-MS監測了VPA在人體內的藥物代謝。通過EESI-MS檢測到呼吸氣中的VPA及其相關代謝物。通過記錄待測物的強度，EESI-MS能夠通過分析接受VPA治療的癲癇患者的呼吸氣樣本來監測VPA的攝入和清除。EESI技術允許以無創和無痛的方式實時測定人體藥代動力學特征，這可能導致傳統治療控制和醫療器械制造的革命。（小編注：近幾年在蘇黎世兒童醫院的大力支持下，EESI/SESI在癲癇患者呼氣監測方面已經無限接近大規模臨場應用，從而真正兌現這項技術給患者帶來的福利。
衍生閱讀?https://doi.org/10.1039/C1CC10343A）
實時直接分析
實時直接分析( direct analysis in real-time mass spectrometry，DART)是另一種通用的AIMS技術，它可以從樣品表面直接解吸的同時電離?(切片、生物體液、活生物體等)，然后進行質譜檢測。
DART離子源中放電產生激發態的氣態原子(如亞穩態氦)，使周圍(大氣)氣體電離，并通過離子分子反應最終使被分析物電離。由于DART可以在開放環境中用于原生狀態(固體、液體和氣體)樣品的分析，該技術有望廣泛應用于臨床和藥理分析或作為POCT設備。
特點
與DESI基于噴霧萃取的機制不同，DART利用等離子體產生離子。因此，DART技術具有與大氣壓力化學電離(APCI)相似的特性。（小編注：DART是化學電離、光電離等多種電離機制復合的氣態化電離途徑，與傳統電噴霧ESI、DESI或EESI響應物質有一定差異，兩者產生的質譜信息有一定的互補性）。在DART中，被激發的氦氣流被用來產生亞穩態物質，隨后與分析物發生反應形成氣態離子。解吸溫度、放電能量、氣體流量和電極與物體之間的距離等因素都會影響DART的電離效率。DART具有一定的電離非極性分子的能力，而非極性分子在常規的DESI分析中較難電離。DART通常適用質量范圍是50到1200 Da。
應用
由于DART對不同種類的分子具有良好的適用性，它已被應用于不同樣品的質譜分析，包括人血漿、奶粉、中草藥等。就人血清而言，酪氨酸是血液中含量最豐富的氨基酸之一，被用作人體健康的一項指標。據報道，利用DART技術成功準確地檢測和定量了酪氨酸（小編注：劉淑瑩課題組通過對尿液和干血斑中氨基酸含量測定，建立新生兒氨基酸尿癥篩查方法）。血清樣品分析前不需要任何預處理。除了特異性化學物質的靶向分析外，還進行了人血清的非靶向篩選。血清或其他體液的代謝組學指紋圖譜可以反映身體健康狀況，也可以作為異常狀況或疾病的潛在指標（小編注：有文獻報道，通過DART產生的廣譜的離子信息，結合生物信息學分析，可以預測乳腺癌和卵巢癌，并對臨床階段準確分型）。
氦氣的溫度是一個重要的影響因素。不同質量范圍內的離子信號對溫度調節的響應不一致，因此氦氣的溫度通常會針對感興趣的分子進行優化。衍生化也是使得復雜混合物中目標化合物信號提升到可檢測水平的一種可行方法。例如，2010年Zhou等人的研究表明，通過應用單、二、三甲基硅烷衍生化，血清中的化合物變得更容易揮發，更容易與DART電極產生的前體離子發生反應，使用這種方法，分析物信號強度增加了15倍，并且只有能夠與衍生化試劑發生反應的分析物強度才會增加。這種有針對性的策略提供了一種從質譜圖譜中獲得更多生化信息的方法。
快速蒸發電離質譜
快速蒸發電離質譜(Rapid evaporative ionization mass spectrometry，REIMS or iKnife)是AIMS的又一突破。
在REIMS中，通常將一個加熱的電手術探針應用到組織上，產生氣態離子(通常是脂離子)的煙霧，隨后通過柔性管和文丘里空氣噴射泵將其轉移到質譜儀中。這使得REIMS能夠實時地為我們提供體內和體外的診斷信息。這種將REIMS技術與電手術技術相結合用于組織診斷也被稱為智能刀(iKnife)。iKnife可以幫助外科醫生在術中確定腫瘤切緣，同時也可以用于腫瘤消融。
特點
iKnife在區分癌癥和正常組織方面的突破性成功，為其很快在癌癥手術中的臨床應用提供了一個強大的平臺。研究者在實驗室中分析了302名患者的各種組織樣本，得到了1624個癌癥和1309個非癌癥數據庫條目。該技術隨后被轉移到手術室，收集了總共81個切除過程中的數據。采用多元統計方法對質譜數據進行分析，包括主成分分析和線性判別分析，并實現了一種識別算法。REIMS方法能準確區分不同的組織學和組織病理學組織類型。術中通過REIMS進行的組織識別與術后組織學診斷的符合率為100%(全部81例)。質譜反映了不同腫瘤類型之間的脂質特征，以及原發性和轉移性腫瘤之間的關系。除了實時診斷信息外，還提供了關于不同腫瘤生物化學的額外信息，這些信息可能在癌癥中具有機制重要性。在測試iKnife時，外科醫生無法看到它的讀數結果。研究人員希望進行一項臨床試驗，看看讓外科醫生使用iKnife的分析是否能改善患者的預后。
應用
這項技術的發明者Takats表示，他相信他的發明可以應用于廣泛的癌癥手術程序。他還認為，除了癌癥診斷之外，它還有可能識別其他特征，比如血液供應不足的組織或組織中存在的細菌類型。
MasSpec Pen
MasSpec Pen是一種手持3d打印筆，由三個端口組成:水滴進入端口，中央端口用于氣體輸送，出口端口用于將含有生化樣品的混合水滴輸送到質譜儀。
一旦筆尖與組織接觸幾秒鐘，水滴就可以從組織中提取并轉移生物分子到質譜儀中。每次使用后，MasSpec Pen都通過快速和自動清洗沖洗或更換一次性筆尖進行清潔。在MasSpec Pen分析后，通過安裝商用加熱ESI源對質譜來進行污染評估，結果證明除質譜中常見的本底峰外，未見脂質污染。
特點
傳統的組織病理組織診斷方法是勞動和時間密集的，并會延誤診斷和治療過程中的決策。研究者使用MasSpec Pen對20個人類癌癥薄組織切片和253個人類患者組織樣本進行體外分子分析，包括來自乳腺、肺、甲狀腺和卵巢的正常和癌變組織。質譜顯示了豐富的分子圖譜，包含多種潛在的癌癥生物標志物，經鑒定包含代謝物、脂質和蛋白質。使用機器學習算法和組織學驗證的分子數據庫構建的統計分類器可以預測癌癥，具有高敏感性(96.4%)、特異性(96.2%)和總體準確性(96.3%)，以及預測甲狀腺良惡性腫瘤和肺癌的不同組織學亞型。這項技術能夠在呈現混合組織的腫瘤邊緣區域進行準確診斷。同時，研究者證明了MasSpec Pen適用于在荷瘤小鼠手術時進行體內癌癥診斷，而不會對動物造成任何可觀察到的組織損傷。這項研究結果證明，MasSpec Pen有可能作為一種體外和體內癌癥診斷的臨床和術中技術。
基質輔助激光解吸電噴霧電離
基質輔助激光解吸電噴霧電離（Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization mass spectrometry ，MALDESI）是一種結合激光燒蝕和電噴霧后電離的混合環境電離技術。
如圖所示，在激光照射下，中性分析物從樣品表面被解吸。這些解吸分析物的羽流與質譜前的正交電噴霧羽流相互作用。這導致分析物通過類似于ESI的過程帶電，隨后進行質譜檢測。最初這種電離使用紫外激光，但最近使用中紅外(IR)激光器(IR-MALDESI)也投入了使用。MALDESI最常見的臨床應用是評估組織標本中內源和外源物的分布。如果沒有基質進行上述電離，則使用UV激光時稱為電噴霧輔助激光解吸/電離(ELDI)，使用IR激光時稱為激光燒蝕電噴霧電離(LAESI)。這兩種技術都已用于體外組織成像。
紙噴霧（PSI-MS）
PSI-MS的特點
由于不需要樣品制備，PSI-MS分析簡單、快速(不到一分鐘)，同時保留顯著的特異性、敏感性和臨床應用定量能力。因此，通過該技術可以在環境條件下快速采集人體血液、尿液和組織樣本，用于質譜分析。這些特性可以使PSI-MS成為疾病檢測和臨床診斷的理想護理設備，因為從裝載樣本到報告結果的整個工作流程只需幾分鐘。目前為止，PSI-MS最廣泛的臨床應用是用于血液中治療藥物的定性和定量檢測，這在藥代動力學和毒理動力學研究中是有非常用的。
PSI-MS的應用
自PSI-MS首次被報道以來，它已被用于監測血液中各種各樣的分子。例如，cooks小組已經成功地證明了PSI-MS能夠在全血樣本中獲得摻雜的伊馬替尼，研究人員使用了含有4ug/mL伊馬替尼的0.4mL全血，通過MS/MS進行識別和定量。分析物的總含量從50pg到5ng，質譜信號可以持續幾分鐘。血漿或血清是新篩脂肪酸氧化障礙診斷中酰基肉堿分析的首選樣本基質。目前，基于流動注射ESI-MS技術是酰基肉堿分析的主要方法。研究人員提出用PSI-MS定量血清和全血中從C2到C18側鏈酰基肉堿的10種不同的酰基肉堿，這項研究結果表明溶劑組成和樣品加載是血清和血液中酰基肉堿分析的關鍵因素。酰基肉堿的定量使用氘化內標，只使用0.5 uL的血清或血液樣本，其檢出限均遠低于臨床驗證的臨界值，在檢測的濃度范圍內具有可接受的線性(R2>0.95)和良好的重現性(RSD，~10%)。這些結果表明，PSI-MS有潛力成為新篩中快速評估酰基肉堿的新技術。
特點
AIMS的特點是它的速度和易于使用的結合，能夠快速、直接和定量分析復雜的生物樣本。正如研究人員所強調的，目前許多AIMS方法都有相對多樣化的應用。很多實例已經證明，程序高度簡化的AIMS可以為臨床實驗室特別是POCT的快速和定量分析鋪平道路。不可否認的是，這種新的技術工具在靈敏度、MS儀器的成本和質量范圍等方面仍有許多挑戰和局限性。針對這些挑戰，有許多研究可以提供一些可能的解決方案。一些課題組提出可以通過將基于芯片的高場非對稱波形離子遷移譜(FAIMS)設備與AIMS連接，可以顯著提高檢測的靈敏度，特別是對大分子的靈敏度。此外，小型化質譜不僅壓縮了臺式系統，而且使儀器成本成為日常測試的可能。
應用
AIMS可能被廣泛接受為一種常規臨床使用的方法，在急診科，甚至門診部，快速的檢測周轉時間比在醫院其他環境中更重要。AIMS未來可能的主要臨床應用方向包括藥物測試和POCT開發。第一個方向是在極短的時間內直接識別合法或非法使用的藥物。在第二種情況下，隨著臨床診斷中AIMS在微型質譜儀上的使用，POCT在集中實驗室甚至醫院之外的使用逐漸成為可能。（小編注：TOFWERK TOF模塊化、緊湊和環境適應性設計不僅僅讓移動實驗室成為可能，也可以在儀器移動過程同時獲得數據成為現實）隨著該領域的繼續成熟，一種低成本、高效率的針對個人醫療的“質譜組學”篩選就可以成為一種常規方法。
供稿：英盛生物儀器開發中心
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