關(guān)于色譜柱HILIC分離模式？收藏這一篇就夠了！

艾杰爾飛諾美

2024.4.26

HILIC—親水作用色譜，是一種互補于RP的色譜技術(shù)，它不僅可以成功提高對極性非常強物質(zhì)的保留，還能夠為包含極性物質(zhì)和可離子化合物的混合物提供正交于RP的獨立分離模式。它是通過采用高乙腈低水含量的流動相與極性固定相的組合，按親水性（極性）由小到大的順序梯度洗脫分析物得以實現(xiàn)的。因所使用的固定相為極性（裸硅膠、酰胺、氨基等），故可輕易吸附水和其他極性溶劑。并且，HILIC不需要添加離子對試劑，可以方便地與質(zhì)譜聯(lián)用，特別適合于電噴霧離子源模式（ESI）。

下面介紹下HILIC方法的開發(fā)指南：

使用梯度條件，確定化合物對HILIC的適用性

1A：90%乙腈等度運行2.5min—這段時間是用來確定一個化合物在HILIC模式下是否弱保留

1B：梯度洗脫設(shè)置時間為7.5min—這段時間是理想的洗脫區(qū)域，開始和結(jié)束時的有機相百分比均可以調(diào)整，以得到最優(yōu)的選擇性。

1C：最后用50%乙腈等度運行2.5min—這段時間是用來確定一個化合物在HILIC模式下是否強保留。

使用兩個不同的pH值篩選適合化合物的方法

流動相的pH在HILIC模式中對保留和選擇性的影響要比在反相分離中大很多。

篩選A

7.5min內(nèi)90%-50%乙腈/緩沖液

緩沖鹽：5mM甲酸銨pH3.2，5mM有效濃度*

通道A：90/10乙腈/50mM甲酸銨pH3.2

通道B：50/40/10乙腈/水/50mM甲酸銨pH3.2

篩選B

7.5min內(nèi)90%-50%乙腈/緩沖液

緩沖鹽：5mM醋酸銨pH5.8，5mM有效濃度*

通道A：90/10乙腈/50mM醋酸銨pH5.8

通道B：50/40/10乙腈/水/50mM醋酸銨pH5.8

維持有效的緩沖液濃度

緩沖液的有效濃度是混合流動相中的緩沖液濃度。在上面的篩選A例子中，5mM甲酸銨的90v/v%乙腈溶液是通過加100mL 50mM甲酸銨pH3.2緩沖液至900mL乙腈中并混勻制得的。沒有必要因體積收縮而調(diào)整。每種流動相中都有5mM的緩沖液是確保在整個梯度過程中流動相離子強度保持恒定，從而有更加耐用的方法。恒定的緩沖液濃度可以通過使用四元泵實現(xiàn)，只需設(shè)置緩沖通道至一個恒定的值，如10% 50mM緩沖液，而不需預(yù)先混合流動相。

使用銨作為緩沖液的陽離子

缺乏恰當(dāng)?shù)年栯x子可能會導(dǎo)致不重現(xiàn)的HILIC的結(jié)果。我們建議使用銨作為有效的反離子，如下所示。

甲酸銨—在HILIC分離中使用5mM甲酸銨在重復(fù)進(jìn)樣后也有穩(wěn)定的保留。

甲酸—在HILIC分離中使用0.1%甲酸(pH2.7)在重復(fù)進(jìn)樣后可能會失去保留。

HILIC只是一種色譜分離模式，并不是色譜柱的簡稱。

目前商品化的HILIC材料的種類日益豐富，涵蓋了裸硅膠、氨基、二醇基、酰胺、糖型、兩性離子型等各種鍵合相，不同的HILIC相之間的選擇性是不同的，不同的HILIC柱應(yīng)視為互補的選擇性。艾杰爾飛諾美可提供的HILIC模式色譜柱有以下幾種：

Luna?NH2

氨基固定相，出廠為正相體系：正己烷/乙腈（99:1），pH：1.5-11。如果用于HILIC模式分離，需先用異丙醇或者純乙醇小流速長時間的置換，再用流動相條件平衡。

Luna氨基色譜柱壽命長，鍵合相流失低，重現(xiàn)性好，為反相條件下的簡單糖、復(fù)雜多糖和糖醇以及正相條件下的氫鍵化合物提供出色的保留能力。

Luna?HILIC

二醇基固定相，出廠條件為：乙腈/100mM甲酸銨（pH3.2）（體積比為90:10），pH：1.5-8.0。

Luna HILIC色譜柱在硅膠表面會保持一個富水層，富水層可以促進(jìn)極性化合物向固定相的轉(zhuǎn)移，從而增加保留。還可提高質(zhì)譜靈敏度，提高實驗室通量和產(chǎn)率。

Kinetex HILIC

裸硅膠為固定相，出廠條件為：乙腈/100mM甲酸銨?(93:7)，pH：2.0-7.5。

1.7μm、2.6μm、5μm可供選擇，區(qū)別與全多孔硅膠，Kinetex HILIC是核殼技術(shù)，即使用納米級的溶膠凝膠處理技術(shù)，在實心硅膠上生成均一穩(wěn)定的多孔外殼。會實現(xiàn)更快的分析、更少的溶劑消耗，同等條件下提高分離度而不增加背壓。

Venusil Honey NH2—食品中糖類檢測專用柱

氨基固定相，出廠條件為：純甲醇，pH：2.0-8.0。

全新艾杰爾Venusil Honey食品中糖類檢測專用柱，專為參考國標(biāo)方法進(jìn)行食品中糖類檢測而設(shè)計，可以有效提高五種糖、尤其是最難分離的麥芽糖和乳糖之間的分離度，是一款性價比超高的食品中糖類檢測的色譜柱。

Luna Omega SUGAR

新型含氮固定相在HILIC條件下

大大增加了糖和糖醇的保留

酰胺多元醇固定相，出廠條件為：乙腈/水?(體積比為80:20或85:15)，pH:2.0-7.0。

Luna Omega SUGAR集熱改性全多孔顆粒的性能優(yōu)勢和新型HILIC固定相于一身，包含酰胺/氨基固定相和極性封尾的多官能選擇性提升碳水化合物的保留和分離。極大地改善了傳統(tǒng)固定相的保留和分離能力，同時還可以獲得更高的峰響應(yīng)，也不需要使用緩沖液或離子對試劑。

BioZen?Glycan

為釋放的多糖提供高效和高選擇

性的理想組合

酰胺多元醇固定相，出廠條件為：乙腈/100mM甲酸銨(pH3.2) (體積比為90:10)，pH：2.0-7.5。

BioZen Glycan的獨特選擇性旨在提供對釋放和標(biāo)記多糖的高階分離。借助2.6μm的核殼顆粒，客戶可在HPLC或UHPLC系統(tǒng)上以更高的線速度獲得更尖銳的峰型，且不額外帶來高背壓。同時，此柱裝填在獨特的生物惰性鈦管中，減少了樣品損失和吸附量。

HILIC色譜柱也有幾點注意事項注意：

流動相中有機相含量：HILIC模式中常用的洗脫溶劑強度由弱到強為：丙酮<乙腈<異丙醇<乙醇<甲醇<水。在這里，水是強洗脫溶劑。另外，流動相中需要至少保持5%的極性溶劑（5%水相/5%甲醇或者3%甲醇/2%水相），這可以保證填料始終被水浸潤。

最常用的緩沖鹽是乙酸銨和甲酸銨，濃度范圍通常為5-100mM。磷酸鹽緩沖液需要注意避免析出的風(fēng)險。

如果可能，盡量用100%乙腈或者初始流動相溶解樣品，避免使用純水溶解，會有溶劑效應(yīng)導(dǎo)致峰型差。

初步探索色譜條件時，可運行95%乙腈至50%乙腈的梯度。（甲醇極性大，一般不使用），常用的條件為75:25的乙腈水或者80:20的乙腈水體系。如果使用梯度洗脫，請注意確保每次進(jìn)樣之前色譜柱得到充分的平衡，如果不這樣做會導(dǎo)致保留時間漂移和重現(xiàn)性較差。

可使用甲醇、乙醇、異丙醇之類的極性溶劑代替水，來增強保留。

色譜柱的清洗及保存：

清洗：體系不含鹽時，可以梯度洗脫從95/5（乙腈/水）至50/50（乙腈/水），以除去極性污染物；若體系含有鹽溶液，需先用等比例不含鹽溶液沖洗一段時間，再逐步提高水相比例，來進(jìn)行清洗。

保存：短期存放可放在乙腈/水（95/5）中，若長期不使用，需保存在純乙腈內(nèi)，并將色譜柱兩端堵頭擰緊封好，以防柱床干涸。

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