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一看就懂！類器官入門級概述——培養分離篇
概念及分類
隨著生物學和醫學研究的不斷深入，傳統的研究模型難以準確反映組織、器官在機體中的生理現象，新的研究模型系統隨之出現。
類器官（Organoid）是來源于干細胞或器官組織的細胞，經過體外三維培養，可分化和自組織形成具有人體相應器官的部分特定功能和結構的細胞團。通俗來說，類器官就是干細胞通過體外3D培養形成的“類似”器官的生物結構。
由于類器官具有人源性，可以模擬器官發育和形成，在體外長期擴增中具有基因組穩定性，并能夠形成活體生物庫進行高通量篩選等優勢，成為近年來備受關注的體外模型。
根據細胞來源不同，類器官可以分為：多能干細胞來源和組織來源。
（1）?多能干細胞來源：人類多能干細胞（Pluripotent stem cell，PSC）具有無限自我更新的能力，并且可以分化為幾乎所有器官特異性的細胞類型。
多能干細胞衍生的類器官又可以包含了胚胎干細胞（Embryonic stem cell，ESC）和誘導多能干細胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）兩類。其中，胚胎干細胞因涉及倫理問題使用受限。
（2）?組織來源：分為正常組織或腫瘤組織衍生的類器官。
正常組織來源：由成體干細胞（Adult stem cell，ASC）刺激分化形成類器官。通常來源于患者的活檢組織，其分化能力十分有限，一般僅含有器官的上皮部分，缺乏基質、神經和血管系統。
腫瘤組織來源：指將患者活檢、穿刺或手術切除組織在基質膠中培養數周得到的類器官。
研究歷史及進展
起源
1907年，美國貝克羅萊那大學教授威爾遜（H. V. Wilson）發現通過機械分離的海綿細胞可以重新聚集并自組織成為新的具有正常功能的有機體，這項發現成為了未來類器官技術發展的起源。
干細胞技術
1998年，美國生物學家James Thomson首次分離得到人胚胎干細胞。飛速發展的干細胞技術為類器官研究帶來了新的契機。
2009年，荷蘭Hans Clevers研究團隊證實了體外培養的腸道干細胞能夠形成類器官。隨后，越來越多科學家們利用多能干細胞和原代成體干細胞培育出多種類器官。
（圖片來源：可畫）
腫瘤類器官
2011年，Sato等人從結腸腺瘤、腺癌及巴雷特食管中建立腫瘤類器官模型，發現腫瘤類器官不僅能夠實現和患者匹配，而且培養高效，有望為癌癥患者在時間窗內提供診療方案。
自此，開啟了腫瘤個性化診斷及治療的新紀元。
2018年2月，《Science》報道了首個腸癌類器官藥敏臨床療效觀察試驗，并獲得了88%的陽性預測值和100%的陰性預測值的結果，首次證明患者來源的類器官可預測抗癌藥物的有效性。
近幾年，抗癌藥物篩選、藥物毒性分析、尋找潛在治療靶點已經成為腫瘤類器官研究的熱點領域。此外，隨著腫瘤類器官培養技術的優化，已經建立起重建腫瘤微環境的方法，為研究腫瘤微環境與腫瘤細胞的互作提供了一個更成熟的模型。
腫瘤類器官的應用前景
類器官技術為腫瘤基礎研究提供了許多新的實驗模型，憑借其多功能性、強大的體內情況建模能力以及快速發展的應用，類器官技術有望在未來繼續對基礎癌癥研究和臨床癌癥治療產生重大影響。
（圖片來源：可畫）
研究發病機制
類器官模型最顯著的優勢是人源性和近生理性，腫瘤患者來源的類器官為研究復雜的、尚未闡明的風險基因位點和表型高度異質性的疾病機制提供可能。
藥物篩選
在藥物研究中，尤其是針對罕見病或缺乏大規模臨床試驗時，類器官能夠為深度測序和功能測試、突變位點或表型分析提供足夠資源，是藥物毒性預測、新藥篩選、個體化治療的較好模型。
精準治療
精準醫療的基本理念是整合個性化疾病信息，從而針對每個患者制定精準的診斷和治療策略。對于癌癥精準治療而言，體外模型必須在生物學特性、基因突變譜上與體內腫瘤保持一致，而且能夠維持高度異質性和基因型穩定性，如今腫瘤類器官的出現為癌癥精準醫療創造了新的機遇。
腫瘤類器官的研究方法
（圖片來源：可畫）
1、?分離樣本
操作步驟：
（1）?分離樣本時注意區分正常組織和腫瘤組織，在提取腫瘤組織時，要盡量提取富含血管和含有上皮細胞的部位，去除壞死組織、脂肪以及肌肉組織。
（2）?分離后的腫瘤組織應留取部分進行凍存，可用于免疫組化切片和分子生物學實驗（和培養后的腫瘤類器官進行對比鑒定）。
（3）?將腫瘤組織剪碎后進一步進行消化解離，可以參考對應的正常組織的消化液，一般由膠原酶、胰酶、DNA 酶和透明質酸構成；消化條件為37℃恒速水平搖床下消化，時間不超過1h，可在消化中途取上清液在鏡下觀察，如果出現3-10個的細胞團形成，則停止消化。
（4）?用100μm篩網對細胞懸液進行過濾，再用PBS清洗篩網，PBS離心洗滌細胞沉淀。
注意事項：
（1）?樣本若不能及時處理，應放入對應的組織樣本保存液中。最好用新鮮取材的樣本做腫瘤類器官培養，成功率更高。
（2）?如果原位取材建系失敗，可考慮取轉移灶中的腫瘤組織，或者分選循環腫瘤細胞進行誘導培養。
2、?種板培養
操作步驟：
（1）?向細胞沉淀中加入適量基底膜提取物（Basement Membrane Extract，BME）。BME的用量取決于細胞數量，約1×10^4個細胞接種在50-60μL BME中。BME需要置于冰上，防止凝固。
（2）?將混合物接種于37℃預熱的培養板上，放入37℃ CO2培養箱孵育30min，待膠體凝固后將培養板取出，加入37℃預熱的培養基。
（3）?每天鏡下觀察類器官的形態、增殖速度、微生物污染等情況，培養2-3天后，根據類器官的生長形態更換培養基。
注意事項：
(1)?基底膜提取物（BME）是一種包含有細胞外基質（ECM）的基質膠，其中包含膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖等成分，為細胞粘附和細胞結構提供了底物。
(2)?細胞種板密度：腫瘤干細胞是腫瘤類器官形成的種子細胞，而腫瘤干細胞在消化后的腫瘤組織懸液中比例極低，這就要求我們種板的密度不能太低。但是太高的種板密度會導致由過多的其它腫瘤細胞凋亡引起的腫瘤類器官培養失敗。所以，建議進行不同細胞密度梯度預實驗來摸索最佳的種板密度。
(3)?腫瘤類器官培養基成分：誘導培養基是在基礎培養基DMEM/F-12中添加各種因子，而這些因子組分是腫瘤類器官形成的關鍵。由于腫瘤組織存在基因突變的個體差異，所以我們需要自行摸索和查閱培養基中添加的各種組分因子，這些組分因子一般都會包含以下四類：
Wnt信號通路激活劑，主要促進血管生成：Wnt信號配體和GR5的配體Rspo-1等
酪氨酸受體激酶的配體，刺激上皮細胞增殖：EGF、FGF10、NGF等
TGF- β信號通路抑制劑，抑制上皮細胞分化：Noggin、A83-01
ROCK抑制劑，保持干細胞多能性：Y-27632
3、?傳代消化
操作步驟：
（1）?棄去培養基后，加入預冷基質膠回收液吹打基質膠，將培養孔內的基質膠全部回收后離心，棄去膠回收液，加入Tryple消化液進行消化，一般消化10~15min，期間可在鏡下觀察，若類器官團塊大部分解離為3~10個的細胞團時，則停止消化。
（2）?消化后細胞進行傳代，此時的細胞含有大量的腫瘤干細胞，消化后的每個細胞小團塊都可能會形成類器官，可根據之前收獲類器官時培養孔內類器官的生長個數和大小綜合考慮傳代密度，一般以第一代的腫瘤類器官種板密度達到20-30%為宜。
注意事項：
如果需要做藥敏實驗，一般建議選擇第一代或者第二代的腫瘤類器官進行，傳代次數越多，發生基因突變的概率越高。
4、鑒定
參考Hans Clevers最早關于乳腺癌類器官的報道，我們可以通過以下層面對腫瘤類器官進行鑒定：
細胞水平：通過顯微鏡和H&E染色觀察形態，鑒定類器官是否具備起源組織的組織病理學特征。
基因水平：通過基因組和轉錄組測序，分析類器官是否保持起源組織的遺傳特征。
蛋白水平：可以用Western Blot、qPCR、免疫熒光、流式細胞術檢測是否表達相應腫瘤標志物。
功能水平：檢測類器官是否具有功能，例如檢測胃類器官能否分泌胃酸、腫瘤類器官的藥敏活性檢測。
丹納赫生命科學的解決方案
丹納赫生命科學通過對旗下品牌的優勢技術與產品進行整合，提供類器官研究從類器官制備到鑒定，以及后續延申的科研應用的豐富解決方案。
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組織/細胞收集
制備類器官的培養基成分差異將造成細胞的發育與分化的差異。丹納赫生命科學旗下貝克曼庫爾特的Vi-CELL MetaFLEX高速細胞培養生化分析儀，能夠快速鑒定培養基組分，具有35s快速檢測、系統免維護等優點。
貝克曼庫爾特Vi-CELL MetaFLEX
高速細胞培養生化分析儀
貝克曼庫爾特的Avanti J-15R冷凍離心機采用UHT（Ultra Harmonic Technology）超平穩技術，離心速度穩定準確。同時，搭配加減速脈沖功能，緩慢增減速有效防止高速制動帶來的細胞損傷。
貝克曼庫爾特Avanti J-15R冷凍離心機
2
3D培養的換液與用藥
貝克曼庫爾特自動化工作站Biomek系列，用吸頭移液方法實現自動化實驗操作，是類器官自動化培養與換液的全能助手。可匹配后續核酸提取以及二代測序DNA/RNA建庫流程，實現從細胞培養到分析應用的全自動化。
貝克曼庫爾特Biomek i5實驗室自動化工作站
對于有藥篩實驗需求的研究，可在Biomek自動化系統基礎上搭配Echo 650移液工作站。利用Echo無接觸、體積小的特點，將化合物轉移到實驗板里。
貝克曼庫爾特Echo 650移液工作站
3
類器官檢測與鑒定
類器官培養后一般需要進行質控的過程，最常見的手段是檢測特異性的細胞表面抗原，從而確定是否發生了明顯的細胞分化。另外，細胞凋亡情況、細胞活力也是常見的檢測參數。貝克曼庫爾特提供CytoFLEX系列流式細胞儀，具有操作簡單、高靈敏度等特點。
貝克曼庫爾特CytoFLEX系列流式細胞儀
使用一般的倒置顯微鏡較難清晰觀察到類器官的多層組織結構，因此需要利用到共聚焦成像、3D成像等新技術手段。丹納赫生命科學旗下徠卡顯微系統的 M系列研究體視鏡與熒光體視鏡，可以直接多角度、多維度觀察細胞的形態與結構。
徠卡M系列研究體視鏡
此外，Leica還提供MICA多模態顯像成像系統，滿足不同檢測精細度及應用目的需要，還可以直接培養并觀察細胞。
Leica?MICA多模態顯像成像系統
丹納赫生命科學旗下美谷分子儀器的ImageXpress Confocal HT. ai智能型共聚焦高內涵成像與分析平臺，在藥效鑒定、藥毒性篩查、科學研究中提供各種類型類器官模型高通量成像與3D分析。
MD?ImageXpress Confocal HT.ai
智能型共聚焦高內涵成像與分析平臺
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