熒光定量常見(jiàn)問(wèn)題分析（四）—StepOnePlus篇

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2023.12.29

上期文章中我們介紹了qPCR實(shí)驗(yàn)中QS3/5的常見(jiàn)問(wèn)題和對(duì)應(yīng)解決方案，本期，我們將著重分析StepOnePlus的相關(guān)案例：

查看實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)熔解曲線（Melt Curve）是異常的（圖1），但同一個(gè)數(shù)據(jù)在另外一臺(tái)電腦上打開(kāi)時(shí)，熔解曲線卻又是正常的（圖2），這是什么原因？

圖1

圖2A

查看多組分圖（Multicomponent Plot）發(fā)現(xiàn)體系中ROX濃度太低（圖3），在QC Summary中也報(bào)了BADROX的錯(cuò)誤。對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，圖1是在熔解曲線選擇了使用Enable Passive Reference Normalization（圖4紅框處），導(dǎo)致熔解曲線不正常，在分析設(shè)置（Analysis Settings->Melt Curve Settings）中取消這項(xiàng)再重新分析即可。另外，建議提高體系中ROX濃度以避免以后繼續(xù)出現(xiàn)這種問(wèn)題。

圖3

圖4

StepOnePlus采用SYBR?Green染料法進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后擴(kuò)增曲線（Amplification?Plot）正常（圖1），但是熔解曲線異常（圖2），這是什么原因？

圖1

圖2A

查看原始數(shù)據(jù)，在多組分圖（Multicomponent?Plot）中發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增循環(huán)階段的熒光信號(hào)呈現(xiàn)鋸齒狀抬升（圖3），說(shuō)明在多個(gè)階段收集了熒光信號(hào)。查看Run method設(shè)置，發(fā)現(xiàn)每個(gè)步驟都采集了熒光信號(hào)（圖4），導(dǎo)致多組分圖擴(kuò)增信號(hào)呈現(xiàn)鋸齒狀以及熔解曲線信號(hào)異常。通常針對(duì)SYBR Green染料法實(shí)驗(yàn)只需在擴(kuò)增階段的退火/延伸步驟以及熔解曲線升溫步驟采集熒光即可。

圖3

圖4

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，發(fā)現(xiàn)有些孔擴(kuò)增曲線（Amplification Plot）異常（圖1），QC Summary中很多孔報(bào)BADROX（圖2），這是什么原因造成的？

圖1

圖2A

查看多組分圖（Multicomponent Plot），發(fā)現(xiàn)SYBR熒光上升時(shí)ROX熒光異常下降導(dǎo)致了BADROX的報(bào)錯(cuò)和擴(kuò)增曲線異常。這個(gè)問(wèn)題是由于SYBR的信號(hào)太強(qiáng)導(dǎo)致的（可能與試劑中SYBR染料濃度過(guò)高有關(guān)），建議使用我們的PowerUp SYBR Green 預(yù)混液。另外，還可以嘗試通過(guò)降低引物濃度來(lái)降低SYBR的熒光信號(hào)，減小其對(duì)ROX熒光的影響。

圖3

相同的引物試劑做的實(shí)驗(yàn)，兩次數(shù)據(jù)ΔRn差異很大，一次是幾十萬(wàn)數(shù)值（圖1），另一次只有個(gè)位數(shù)數(shù)值（圖2），是什么原因？

圖1

圖2A

第一個(gè)數(shù)據(jù)設(shè)置時(shí)，Passive Reference 選了None（圖3）,第二個(gè)數(shù)據(jù)設(shè)置時(shí)選擇了ROX（圖4）, 這是設(shè)置不同導(dǎo)致的分析差異。如果選擇了ROX，ΔRn的計(jì)算值會(huì)采用ROX做均一化，從而數(shù)值較小。建議根據(jù)試劑中是否包含參比熒光ROX來(lái)選擇設(shè)置方法。

圖3

圖4

熒光定量結(jié)果有2個(gè)樣本的Ct值異常，如圖所示，E3、F3兩孔?Ct值分別為14.24和13.31，但是擴(kuò)增曲線（Amplification plot）都在22個(gè)循環(huán)以后出現(xiàn)抬升（圖1），這是什么原因？

圖1A

查看多組分圖（Multicomponent plot ），如圖2所示：E3、F3的基線期熒光信號(hào)有輕微上升，可能是因?yàn)樘结樅鸵锵嗷プ饔没蛘吣０遒|(zhì)量問(wèn)題等因素，導(dǎo)致軟件自動(dòng)判斷基線期錯(cuò)誤。需要手動(dòng)調(diào)整基線設(shè)置，按如下步驟設(shè)置：Analysis->CT Settings ->取消勾選Use Default Settings，Automatic Threshold，Automatic Baseline->手動(dòng)調(diào)整End cycle->