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差示掃描熒光法表征蛋白配體互作，不加染料的那種
【實驗解讀】
差示掃描熒光法（DSF），也被稱為thermal shift assay（TSA），是表征蛋白熱穩定性的常用方法之一，廣泛應用于蛋白配體互作表征，突變體、緩沖液、去垢劑篩選等領域。
DSF可以通過熒光染料或蛋白內源熒光信號監測升溫過程中蛋白構象的變化計算其熔解溫度Tm（折疊蛋白與去折疊蛋白相等時的溫度）。染料法DSF最常用的是SYPRO Orange染料，蛋白去折疊疏水區暴露時，疏水染料SYPRO Orange便會結合至該區域，熒光強度增加（圖1）。無標記DSF則是基于蛋白去折疊過程中色氨酸發射光譜的位移進行檢測（圖2）。
圖1. 染料法DSF
圖2. 無標記DSF
當配體的結合增強蛋白穩定性時，其熔解溫度Tm也會升高。如下圖所示，未加入ATP時，Hsp90 蛋白的Tm為63.46℃，在加入ATP后，結合增強了Hsp90蛋白的穩定性，Tm升高至67.53℃。因此我們可以利用該方法進行蛋白結合活性的快速驗證或高通量配體定性初篩。
圖3. PR蛋白穩定性分析儀表征蛋白配體互作
在進行蛋白配體互作表征時，染料法DSF存在一定的局限性。外源加入的染料結合至蛋白可能會直接影響蛋白的穩定性或干擾蛋白與配體的結合，并且在蛋白形成聚集時，染料會發生解離，不適用于多結構域蛋白的檢測。例如醛脫氫酶1A1 (ALDH1A1)在用SYPRO Orange染料檢測時僅有一個熱變性峰，并且在加入輔因子NAD+和已知的抑制劑NCT-501后并沒有出現明顯的Tm變化（圖4a）。而使用PR蛋白穩定性分析儀進行無標記DSF檢測時，ALDH1A1呈現出兩個熱變性峰，在加入輔因子NAD+后，第一個熱變性峰明顯右移。繼續加入抑制劑NCT-501后，第一個熱變性峰消失，蛋白穩定性增強（圖4b）[1]。
圖4 ALDH1A1 DSF檢測對比
此外，染料法DSF的實驗操作較繁瑣，需要根據蛋白的特性及去垢劑兼容性選擇合適的染料，優化蛋白和染料的比例，在配制樣品時還要考慮染料自帶的有機溶劑對蛋白的影響。而用PR蛋白穩定性分析儀進行無標記DSF實驗時，稀釋好樣品就可以直接上機檢測了。
小編也準備了完整的上機檢測視頻供大家參考。
除了無標記DSF（nanoDSF）檢測模塊外，PR蛋白穩定性分析儀還可搭載動態光散射（DLS），靜態光散射（SLS）和背反射（Backreflection）模塊，只需要10μl樣品就可以完成均一性，熱穩定性，膠體穩定性的檢測。我們還提供自動化解決方案，便于客戶進行無人值守的高通量篩選。
圖5 機械臂自動上樣的PR蛋白穩定性分析儀
[1] Labrou N E.Targeting Enzymes for Pharmaceutical Development Methods and Protocols: Methods and Protocols[J]. Methods in Molecular Biology, 2020.
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