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復(fù)雜多肽樣品處理案例分享——β-淀粉樣蛋白多肽的純化進(jìn)階之路
在多肽研究領(lǐng)域，復(fù)雜多肽往往具有較高研究?jī)r(jià)值，但由于其結(jié)構(gòu)的繁雜性，處理起來(lái)也比較困難，不管是對(duì)合成，純化還是最終的分析檢測(cè)，其實(shí)難度都是成倍數(shù)增加，但科學(xué)實(shí)驗(yàn)就需要我們進(jìn)行難題的攻克！Biotage 一直致力于多肽藥物的合成以及純化研究，為您提供相應(yīng)的合成純化解決方案。我們將用一個(gè)特別難處理的肽作為一個(gè)案例，為您提供一些提高純化效率的思路和策略。
對(duì)于此β-淀粉樣蛋白多肽，在藥物多肽鄰域，其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，含有大量疏水性氨基酸，并且許多氨基酸沿著40或42個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度成片聚集在一起，因此合成它們很有挑戰(zhàn)性。同時(shí)在脫保護(hù)之后，由于這些肽溶解度很小，在溶液中很容易聚集或纖維化，因此極難純化。
此次我們使用Biotage? Initiator+ Alstra?多肽合成系統(tǒng)，合成了β-淀粉樣蛋白1-40? 。在研究和優(yōu)化了合成方案之后，我們毫不費(fèi)力地得到了相當(dāng)不錯(cuò)的合成結(jié)果，如圖1所示。
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圖1.溶于DMSO的合成A-β1-40的粗分析HPLC。主要產(chǎn)品是所需的含有大量氧化后的多肽(O)產(chǎn)品。并且我們并沒(méi)有采取任何措施來(lái)減少在合成或樹(shù)脂裂解過(guò)程中發(fā)生的Met氧化。
目前最新的研究已經(jīng)發(fā)布了通過(guò)重新溶解一些關(guān)于在溶液中重新溶解純化后的β-淀粉樣蛋白而產(chǎn)生對(duì)應(yīng)單肽的指導(dǎo)方法，
我們決定按照發(fā)布的指導(dǎo)方法溶解我的粗肽樣品，而不是嘗試發(fā)明一種新方法。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)，我想評(píng)估兩種溶解策略——DMSO和堿性水溶液。我們需要考慮的一個(gè)重要因素是流動(dòng)相改性劑（調(diào)節(jié)pH值），完全單體的可溶性多肽一旦和色譜柱接觸時(shí)，它們很可能會(huì)立即聚集，從而不利于純化。因此起先我們用TFA調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH值做了一些實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其效果一般，隨后我們將流動(dòng)相改性劑改為0.1%NH4OH用于最終的實(shí)際純化實(shí)驗(yàn)。
在純化開(kāi)始階段，我們對(duì)梯度進(jìn)行了一些優(yōu)化，起始我們使用最簡(jiǎn)單的梯度洗脫，通過(guò)對(duì)粗產(chǎn)物的分析，我們發(fā)現(xiàn)階梯式梯度效果更好，一般來(lái)說(shuō)階梯式梯度的效果會(huì)好于常規(guī)的梯度洗脫；
最后我們把大約100mg的粗品溶解在500μL的DSMO中，通過(guò)注射器濕法上樣后純化，如圖2所示。
圖2.使用階梯式梯度方法進(jìn)行多肽分子Aβ1-40的Flash純化譜圖。圖中四個(gè)峰為后期分析后標(biāo)記出來(lái)的四個(gè)產(chǎn)物組分峰。系統(tǒng)：Isolera?Dalton 2000，色譜柱：Sfar Bio C18。
說(shuō)實(shí)話，這個(gè)色譜圖讓我有些驚訝。注入的DMSO溶液是完全透明的，表明它沒(méi)有發(fā)生聚集。然而，峰的形狀和數(shù)目卻表明并非如此。我決定濃縮部分溶液，并對(duì)每個(gè)標(biāo)記峰的相對(duì)純度進(jìn)行研究，如圖3所示。
?圖3：峰1、峰2、峰3和峰4的HPLC樣品分析對(duì)比圖。如預(yù)期，峰1主要為多肽的氧化產(chǎn)物，而其他三個(gè)峰含有所需肽的濃度則有所下降。另外，峰2和峰3的HPLC組成幾乎相同。
可以發(fā)現(xiàn)，所有組分都含有氧化肽和目標(biāo)多肽，只是濃度不同。氧化肽的存在可能源于以下幾個(gè)原因：
???純化本身分離度不高
???純化完成，后處理期間目標(biāo)多肽發(fā)生了氧化
???純化過(guò)程中，氧化肽與目標(biāo)肽產(chǎn)生了聚集
特別是峰2和峰3，氧化肽：目標(biāo)肽的比例（ox：pdt）幾乎相同，而最顯著的差異是，峰3樣品中的產(chǎn)物峰更寬。這個(gè)因素雖小，但不容忽視。盡管這兩個(gè)樣品的分析成分相似，但在初始純化過(guò)程中，它們的色譜行為卻大相徑庭-特別是峰2。色譜差異表明這兩個(gè)樣品很可能存在構(gòu)象或低聚差異。很遺憾，目前的工具，我們無(wú)法確定這些構(gòu)象差異是什么。
隨后，我們決定進(jìn)行第二次純化，此次，我將乙腈作為溶劑的一部分。結(jié)果側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)仍然以固體形式存在，降低了其在水中的溶解度。這種情況下，樣品幾乎會(huì)立即形成凝膠（早期聚集和可能的纖維化）。通過(guò)溶于溶于25%的MeCN（aq）+1%NH4OH溶液中，使用相同的方法和粗品量，我們會(huì)會(huì)得到完全不同的Flash純化譜圖，如圖4所示。
圖4.將粗品溶解在溶解在25％MeCN（aq）+ 1％NH4OH溶液中，使用階梯式梯度方法進(jìn)行多肽分子Aβ1-40的Flash純化譜圖。圖中四個(gè)峰為后期分析后標(biāo)記出來(lái)的四個(gè)產(chǎn)物組分峰。系統(tǒng)：Isolera?Dalton 2000，色譜柱：Sfar Bio C18。
與之前一樣，峰的數(shù)量仍然比原始分析所預(yù)期的要多。但是，考慮到聚集（膠凝）效應(yīng)，這個(gè)結(jié)果就不奇怪了。但重要的是峰的形狀改善了，這表明溶液中存在的構(gòu)象差異較少，整體純化效率可能得到了提高。對(duì)四個(gè)標(biāo)記峰進(jìn)行進(jìn)一步分析，如圖5所示。
?圖5. 峰1、峰2、峰3和峰4的HPLC樣品分析對(duì)比圖。
如預(yù)期，峰1含有大量的氧化產(chǎn)物，而峰2主要含有目標(biāo)多肽和以及一部分氧化產(chǎn)物。其余兩個(gè)峰也含有氧化產(chǎn)物和目標(biāo)產(chǎn)物的混合物，但相對(duì)濃度有所增加。根據(jù)峰保留時(shí)間以及對(duì)應(yīng)的極性的增加，我們判斷峰3和4可能是所需肽的不同低聚形態(tài)。
從第二次改進(jìn)的進(jìn)樣方式所得到的圖譜可以發(fā)現(xiàn)，效果得到了改善，更符合我對(duì)粗略分析色譜圖的預(yù)期。峰1含有大量氧化肽和目標(biāo)產(chǎn)物肽，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)峰2基本上是所需目標(biāo)產(chǎn)物，表明這可能是單體目標(biāo)產(chǎn)物，基于這些結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn)這組溶劑純化條件肯定比DMSO溶劑的純化效率更高。
最后，我們決定使用1% NH4OH（aq）溶解約100mg粗肽樣品，然后將其進(jìn)行純化，如圖6所示。通過(guò)將樣品快速的稀釋到緩沖溶液當(dāng)中不僅打破了預(yù)先形成的低聚體，而且可以最大程度地將樣品保持單體狀態(tài)。
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圖6. 將粗品溶解在溶解在1％NH4OH（aq）溶液中，使用階梯式梯度方法進(jìn)行多肽分子Aβ1-40的Flash純化譜圖。得到了三個(gè)主要的色譜峰。系統(tǒng)：Isolera?Dalton 2000，色譜柱：Sfar Bio C18。
變化非常明顯，樣品已經(jīng)由原來(lái)的四個(gè)峰縮短至三個(gè)峰；相比以前的純化實(shí)驗(yàn)，峰的形狀和分離度甚至有所提高。雖然在純化開(kāi)始前溶解的樣品有一點(diǎn)渾濁，但對(duì)分離實(shí)驗(yàn)沒(méi)有什么影響。與之前兩種純化方法相比，這次圖譜里面的峰的色譜的“不良行為”最少。
隨后我們將三個(gè)標(biāo)記的峰濃縮并通過(guò)分析HPLC進(jìn)行評(píng)估，如圖7所示。
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圖7.??峰1、峰2和峰3的 HPLC樣品分析對(duì)比圖。
可以看到雖然峰1和峰3保留率有顯著差異，但是含有的成分幾乎相同。與之前的純化一樣，第一個(gè)峰是由于氧化物而產(chǎn)生，并且和目標(biāo)肽有一定的交叉。值得注意的是，目標(biāo)多肽在峰2中的含量是三個(gè)方法中比例最高的，這可以當(dāng)作一種后期方法改進(jìn)的參考變量。
我們希望通過(guò)這些對(duì)于數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)明，在純化前考慮純化效率時(shí)，選擇溶劑以及對(duì)應(yīng)的溶劑條件往往十分重要。純化工作已經(jīng)成為大多數(shù)多肽團(tuán)隊(duì)的瓶頸，行動(dòng)之前多查閱文獻(xiàn)，多思考或者和我們溝通和交流，都有助于解決一些可能出現(xiàn)的純化問(wèn)題，甚至解決由于產(chǎn)量低而導(dǎo)致的后期再合成問(wèn)題。
如果你想了解更多關(guān)于這方面的問(wèn)題，以及了解其他可以提高你的多肽純化效率的策略，歡迎留言和我們聯(lián)系。
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