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Nature Materials: 細胞-基質復合模型(CoCS)修正軟基質形變效應獲取真實細胞彈性模量
布魯克文章推薦 第40期?
Bruker Journal Club
? ? ? ? ? ? ??布魯克納米表面儀器部? 王鑫 博士
細胞的表觀模量已經成為研究細胞力學、表征細胞生理特點的重要物理參數。在細胞遷移、黏附于生長的過程中表觀模量也會發生變化。細胞周圍的生長環境的軟硬會顯著的調控細胞的力學行為，因此在不同軟硬的培養基質上獲取細胞真實的彈性模量就顯得尤為重要。傳統的基于AFM力曲線測通過Hertz模型獲取細胞彈性模量。如果細胞培養基質很軟，則在力曲線實驗中基質同樣會產生很大形變，細胞的彈性模量會因為 “軟基質效應“被顯著低估。英國劍橋大學的Kristian Franze教授及其團隊在傳統Hertz模型基礎上發展了細胞-基質復合模型(composite cell–substrate model，CoCS模型)，并通過CoCS模型很好的修正了”軟基質效應“獲取了細胞真實的彈性模量。相關工作(Cortical cell stiffness is independent of substrate mechanics)于2020年5月25日發表在《Nature Materials》雜志上(DOI: 10.1038/s41563-020-0684-x)。
AFM力曲線測試中，通過Hertz模型擬合力曲線中加載力與細胞形變的關系獲取彈性模量，
其中，r為探針半徑，νcell為細胞泊松比，近似可取νcell ≈ 0.5，Ecell為細胞的表觀彈性模量。細胞的形變可以通過壓電陶瓷位移ΔZ與探針偏轉型變量d獲得，δ = ΔZ-d。在玻璃或者塑料材質的培養皿上培養細胞能很好的符合這一模型假設，從而獲取可靠的細胞表觀彈性模量。然而，當細胞在很軟的水凝膠基底上進行培養時，即使很小的加載力也會使細胞對基底產生顯著形變，從而使總的形變量δ包含細胞的形變量δ cell與基底的形變量δ substrate兩部分，即δcell + δ substrate = ΔZ-d。常規的Hertz模型分析因此無法很好的應用于軟基質培養的細胞。
AFM將細胞壓入柔軟基質的形變量測量
硬度較小的小膠質細胞培養在不同硬度的聚丙烯酰胺(PAA)水凝膠上(E substrate = 50 Pa ~ 20 kPa)。 AFM和共聚焦顯微鏡聯合使用，通過熒光圖像分析探針以不同壓力將細胞壓入基質產生的基質形變量δ substrate變化。共聚焦成像顯示，在較硬的基質上(E substrate = 2 kPa)，探針加載到細胞的力對基質的形變并不顯著(圖 1a)，與之相對的，在較軟的基質上(E substrate = 100 Pa)，施加到細胞上的力對基質產生了微米量級的形變(圖1b)。進一步的分析表明，施加到細胞上的力與基質的形變量δ substrate成正比(圖1c、d)。基質的剛度可以通過斜率c = δ substrate/F來比較，對于硬基質與軟基質，斜率分辨率0.9 μm/nN和0.1 μm/nN。
基質形變與應力分布的模型建立與數值模擬
為了精細的測量細胞對基質相互作用應力與形變的分布，使用 ERISM成像測量基質的形變量與應力的空間分布。ERISM成像表明，懸臂對細胞施力的正下方中心，有著最大形變量與最大應力，形變與應力隨著遠離中心近似線性衰減，在10 μm以外逐漸衰減到零。假定細胞與基質接觸為軸對稱的，中心最大應力為σ0，經過距離R應力衰減為零，這樣的接觸可以用Boussinesq表示描述，
這里取νsubstrate ≈ 0.5，對于很軟的PAA水凝膠基質可以很好的描述。球形探針與細胞的接觸仍可采用Hertz模型，即，
前面提到了力曲線測得的形變量包含細胞與基質的形變，即，
結合式③與式④可以得到細胞-基質復合模型，即CoCS模型，
根據上面的分析，對于球形探針，這里取,
其中c與基質的彈性模量成反比，可以用來描述基質的形變特性。數值模擬表明，在較硬的基質上，Hertz模型與CoCS模型都可以很好的擬合應力-形變曲線。而在柔軟的基質上，Hertz模型無法精確擬合，CoCS模型可以很好的修正基質形變帶來的影響從而獲取樣品本征的彈性模量(圖2)。
PAA凝膠珠驗證CoCS模型的可靠性
通過合成尺寸、彈性與細胞相似的PAA凝膠珠(1 ~ 2 kPa)，將PAA凝膠珠放置在硬基質(E substrate = 10 kPa)與軟基質(E substrate = 1 kPa)上測量PAA凝膠珠的彈性模量。結果表明，Hertz模型僅能在硬基質上良好擬合獲取彈性模量，在軟基質上，Hertz模型顯著低估了凝膠珠的彈性模量。而CoCS模型可以在硬基質與軟基質上很好的獲取凝膠珠的彈性模量，且不同軟硬基質上獲取的彈性模量數據無顯著差異(圖3f)。可見CoCS模型很好的排除了基質形變帶來的影響。此外，使用CoCS模型擬合得到的參數c可以很好的反應基質的形變難易特性(圖 3e)。
CoCS模型擬合基質培養細胞的彈性模量
小膠質細胞培養在軟硬各異的PAA凝膠基質上，使用Hertz模型與CoCS模型獲取細胞的彈性模量進行比較。結果與PAA凝膠珠的測試結果十分一致，即Hertz模型僅在硬基質上能較好的擬合，且在軟基質上大大低估細胞的彈性模量，而CoCS模型可在硬基質與軟基質上均獲得可靠的結果(圖 4a~f)。細胞內的肌動蛋白與細胞的彈性模量有著密切關系，同時可以通過感知培養基質的軟硬來調控細胞模量。Blebbistatin肌動蛋白抑制劑處理后，細胞失去對基質軟硬感知能力，同時細胞本身模量降低。降低的細胞模量使基質模量與細胞模量之比更大，Hertz模型的擬合會更加準確。對Blebbistatin未處理的細胞本身模量較高，基質模量與細胞模量之比較小，Hertz模型擬合會低估細胞的模量。這時，Blebbistatin處理細胞與否對模量影響的顯著性就會下降。使用CoCS模型可以很好的排除基質軟硬對細胞模量測量的影響，可以更好的還原細胞本征的力學特性 (圖 4h)。
為了進一步驗證該模型的準確性，該工作還使用Hertz模型測得的細胞彈性模量進行回歸分析。可以看出，隨著基質模型與細胞模量比值增大，細胞模量越接近硬基質上測定的細胞模量(圖 5)。回歸分析的數據與數值模擬(圖 2e)的有著一致的趨勢，再次說明了Hertz模型對細胞模量低估的機理與CoCS模型的可靠性。
該工作使用了Bruker JPK NanoWizard?與 CellHesion? 200結合熒光顯微鏡與共聚焦顯微鏡完成。CellHesion?可以提供高精度的超大Z方向量程，用于球形膠體探針與細胞模量、粘附力等生物力學的測試。Bruker全新的NanoWizard? 4 XP BioAFM可以通過結合CellHesion? 200掃描器、CellHesion?模塊或HybridStage?實現高精度超大Z方向量程。同時NanoWizard? 4 XP BioAFM可以結合多種先進光學顯微鏡(例如共聚焦、轉盤式共聚焦顯微鏡、全反射顯微鏡、超分辨技術與單分子熒光技術)。
本文相關鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41563-020-0684-x
NanoWizard? 4 XP BioAFM簡介：
https://china.jpk.com/products/atomic-force-microscopy/nanowizard-4-xp-bioafm
CellHesion? 200簡介：
https://china.jpk.com/products/cell-tissue-mechanics-and-adhesion/cellhesion-200
CellHesion? 模塊簡介：
https://china.jpk.com/products/cell-tissue-mechanics-and-adhesion/cellhesion-module
HybridStage?簡介：
https://china.jpk.com/products/atomic-force-microscopy/nanowizard-4-xp-bioafm/accessories/hybridstage
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