一、硬件操作
熒光分光光度計在使用時，需要注意開機次序，以保護設備之間不受影響。熒光光譜儀開機順序一般為先開氙燈，然后開儀器主機，最后開跟儀器連接的計算機。如此操作的原因在于穩態氙燈是高壓點亮，為了避免瞬問脈沖電流對周圍設備造成影響，需要先開氙燈，等電流穩定后再打開周邊的電腦等設備。關機順序則相反。
二、軟件操作
熒光定量分析多采用工作曲線法，即以已知量的標準物質，按試樣相同方法處理后，配成一系列標準溶液，測定其相對熒光強度和空白溶液的相對熒光強度；扣除空白值后，以熒光強度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制工作曲線；然后將處理后的試樣配成一定濃度的溶液，在同一條件下測定其相對熒光強度，扣除空白值后，從工作曲線上求出熒光物質的含量。
在用熒光分析法測定某些會引起熒光改變的微量物質時，常采用差示熒光法，可使熒光強度的讀數差距拉大，使熒光強度的降低加大，從而提高方法的靈敏度和準確度。
下面以日立F-4500熒光分光光度計的使用為例，具體介紹如何在儀器上進圖譜掃描、濃度分析等定性、定量測試操作。
1.圖譜掃描(WavelengthScarl)簡明操作：
①打開光譜儀電源開關(POwER)，5s后再按下氙燈點燈按鈕，當氙燈點燃后，再接通主開關(MAIN)。此時主開關上方綠色指示燈連續閃動三下，然后開計算機、顯示器、打印機。計算機進入操作系統。
②運行FL-Solution控制軟件。
③建立試驗方法(發射光譜)，設置測量參數：點擊快捷欄“Method”后，立即顯示了分析方法(AnalysisMethod)的五個重疊界面，分別為“常規”(Gen—eral)、“儀器條件”(Instnlinent)、“模擬畫面”(Mmlitor)、“處理”(Processing)、“報告”(Report)。
下面詳細介紹每個界面：單擊“常規”按鈕，測量方式選擇波長掃描Wave一1ength)；單擊“儀器條件”按鈕，掃描方式選為發射波長掃描。激發波長的輸入范圍為200～900nm，發射起始波長的輸入范圍200～890nm，發射終止波長的輸入范圍210～900nm。選定合適的掃描速度、延遲時間、發射單元狹縫、光電倍增管負高壓，設置發射單元狹縫、響應速度、重復次數等參數。
④進行樣品掃描：將待測樣品倒人四面通光的石英比色皿中，并將其放入儀器的樣品架中。點擊測量按鈕，儀器便開始對樣品進行掃描測量。
⑤存儲掃描譜圖：在文件菜單“另存為”，輸入文件名，按“保存”將數據保存。
⑥打印譜圖：打印樣品掃描譜圖。
⑦測試結束，將比色皿取出，清洗，晾干。退出軟件，關閉計算機，在軟件上將氙燈熄滅，待其冷卻到室溫時才關光譜儀主機。
注意：測試結束不要急于關閉光譜儀主機電源。務必等到氙燈冷卻后，才關光譜儀主機。可以將手放在儀器主機上面左側的散熱窗口處，感受其溫度，直到其溫度降到室溫時，才能關閉光譜儀主機。
2.濃度分析簡明操作
光度計法亦稱濃度直讀法，也稱工作曲線法。利用配制的具有梯度的標準樣品，先做出一條標準曲線，然后再反測未知樣品。
①打開光譜儀電源開關(PowER)，5s后再按下氙燈點燈按鈕，當氙燈點燃后，再接通主開關(MAIN)。此時主開關上方綠色指示燈連續閃動三下，然后開計算機、顯示器、打印機。計算機進入操作系統。
②運行FL—Solution控制軟件。
③建立試驗方法(光度計法)，設置參數：測量方式(MeasureHlent)選擇光度計(Photometry)，定量條件：測量類型(Quantitationtype)選擇指定波長(Wavelength)，曲線校正類型(Calibrationtype)選擇一次線性方程，設置波長數(Numberofwavelengths)、濃度單位(Concentrationunit)。波長方式(Wavelengthmode)：激發波長與發射波長均固定，波長選定后輸入具體值。選定合適的發射單元狹縫與激發單元狹縫，設定光電管負高壓、重復次數等參數。
標準樣品表(Standards)：標準樣品數目的設定(Numberofsampies)為1～20間。修訂確認(Update)：當標樣數確定后，點擊此框后顯示標樣表以供賦值。如果需要臨時插入一個標樣條目，可點擊插入(Insert)鍵；如果需要臨時刪除一個標樣條目，可點擊刪除(Delete)鍵。
④進行樣品測量：放入標準樣品，點擊測量按鈕，儀器便開始對標樣進行測量。未知樣品測量點擊F4鍵，結束測量點擊F9鍵。
⑤存儲數據：在文件菜單“另存為”，輸入文件名，按“保存”將數據保存。
⑥打印數據。
⑦測試結束，將比色皿取出，清洗，晾干。退出軟件，關閉計算機，在軟件上將氙燈熄滅，待其冷卻到室溫時才關光譜儀主機。
3.三維掃描的簡易操作
當某個樣品不知最佳激發波長和最佳發射波長時，利用該功能可自動快速地給出最佳條件，并可供其它特殊分析用。
①打開光譜儀電源開關，氙燈。
②運行FL-Solution控制軟件。
③建立試驗方法(光度計法)，設置參數。
a．General(常規)
MeasuremerLt(測量方式)——選擇3-DScan方式。
b．Instnlment(儀器條件)
Datamode(數據方式)——可選擇Fluorescence熒光或Phosphorescerlce磷光。
ExstartWL(激發起始波長)——200～850nm間選擇。
ExendWL(激發終止波長)——200～900nm間選擇。
EXsamplinginterval(激發掃描間距)——1～50nm間選擇。
EMstartwL(發射起始波長)——200～850nm間選擇。
EMendwL(發射終止波長)——200～900nm間選擇。
EMsamplinginterval(發射掃描間距)——1～10nm問選擇。
Scanspeed(掃描速度)——任選。如為了快速，可選30000nm／min。
④進行樣品測量。
⑤存儲數據。
⑥打印數據。
⑦測試結束，關機。
三、工作參數條件的選擇
1.激發波長的選擇
該怎么確定激發波長與發射波長呢?對許多儀器初學者來說，這是個令人感到困擾的問題。如果儀器有三維掃描功能，那就比較簡單，放樣品進去，按照說明書要求做三維熒光掃描，可以很方便地確定出合適的激發波長與發射波長。如果儀器沒有三維掃描功能，一般的方法如下。
首先，將儀器的激發波長（λem）先設定為200nm，然后進行發射(EM)模式掃描，發射波長（λem）掃描范圍暫設定為210～800nm，記錄所有出現的峰值波長；改變激發波長（λem）后再掃描，如第二次發射圖譜中的某個(或某些)峰的位置沒有位移(或位移很少)，一般來說這個(或這些)峰就是熒光峰；因為熒光峰的位置是不隨激發波長的改變而改變的，僅是峰高(或峰面積)發生改變。
然后，將確定的熒光峰的波長作為發射波長(λem)固定下來，再做激發波長(Ex)的掃描，激發波長的范圍要小于發射波長；如果僅出一個激發峰則很簡單確立下來，再將這個波長固定下來重新做真正的發射波長(EM)掃描，可以得到具有良好信噪比的結果；如果做激發波長(EX)掃描后出現幾個峰，則根據經驗來選擇，一般應選擇峰形、高度適合且有一定帶寬的峰作為激發波長。也可以參考熒光光譜的特性——激發光譜與發射光譜呈鏡像的特點來確定激發波長。
2.濾光片的選擇
在進行發射圖譜掃描分析時，根據斯托克斯定律，設置的激發波長要比發射波長短，例如，激發波長λex=260nm，則發射起始波長應該從大于260nm的波長開始，比如270nm，發射結束波長為870nm。這樣一來，在激發光的2倍波長(520nm)、3倍波長(780nm)處都會出現激發波長的尖銳的倍頻峰，若與熒光光譜峰重疊，將會對測試產生干擾，需選用合適的濾光片將其濾掉。
倍頻峰就是激發光的散射峰，雖然波長掃描到雙倍波長的時候出現，但實際波長卻是激發波長，可以通過增加高通濾光片來去除倍頻峰。高通濾光片一般放在發射處，片上都標明其可以濾除的最大波長。也就是說，體系中增加高通濾光片后，比其上所標波長低的光，也包括這些光的二倍波長光、三倍波長光，會被濾掉；而比其所標波長高的光則可以順利通過。
3.狹縫的設置
熒光強度跟很多因素有關，如分子結構、存在狀態、溶液濃度或薄膜厚度、溫度、選擇的激發波長、測試狹縫寬度等因素。熒光強度在不同儀器上的測量值存在較大差異，不具有可比性，但是其峰位還是較容易確定的，可以用來判斷何種物質。進行熒光定量分析，必須固定一些條件。
狹縫的大小對熒光強度很重要，狹縫大小可根據你所測物質的熒光強度大小作出適當的調整。在同一濃度，如熒光強度過大，超過儀器量程，可減小狹縫。但是，需要指出的是，不能僅憑狹縫的大小來改變熒光強度，還要考慮分辨率的問題。對于熒光掃描而言，狹縫加大可以使熒光強度提高同時重現性得到提高，但是分辨率隨之降低。狹縫決定分辨率，儀器其它結構已經固定(光柵的刻線數、焦距以及綜合的線色散系數)，狹縫大小就決定分辨率的高低。對于實際使用，狹縫大小需要和測定的峰的半峰寬相匹配，過大，峰就變形了。狹縫大小也決定了光通量大小。按照經驗數值，狹縫開大1倍，光通量將增大4倍。
4.步長的設置
測量的步長小，測量會慢些，好處足圖譜細膩些；步長大，測量速度快，譜圖就顯得粗糙些。步長設置最好小于需要測量最小半峰寬的1／5，因為步長會與分辨率相關的。原則上，步長應小于3倍的狹縫寬度。
四、測試注意事項
熒光強度容易受外界因素的影響，如樣品池、激發光源、溫度、溶液的pH值、溶劑性質、其它溶質、表面活性劑等都會造成熒光強度的變化。嚴格控制測試條件對熒光分析來說至關重要。
①樣品應盛在四面透光的石英比色皿(熒光池)中，如果是揮發性樣品應使用帶塞的熒光池。
②在熒光分析時，為了得到穩定可靠的數據，一般需要開機預熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預熱時間可以縮短到10min左右。對某些易感光、易分解的熒光物質，盡量采用長波長、低入射光強度及短時間光照。
③溫度變化可引起熒光強度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量子產率，熒光強度增大。溫度影響熒光強度的顯著程度因樣品而異，大部分熒光物質的熒光強度受溫度影響不大，測試溫度變化不超過±3℃，對測試結果幾乎無影響。
④當熒光物質是弱酸或弱堿時，溶液的pH對熒光強度有較大影響。因為弱酸或弱堿在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會發生改變，而熒光物質的熒光強度會因其離解狀態發生改變。以苯胺為例：在pH=7～12的溶液中會產生藍色熒光，在pH<2或pH>13的溶液中都不產生熒光。再如，維生素B2(核黃素)在430～440nm藍光照射下會發出綠色熒光，λem為535nm。它在pH=6～7的溶液中熒光強度最大，而在pH=11時熒光消失；但在堿性溶液經光線照射發生分解作用或在酸性KMnOt氧化下都會生成熒光強度比維生素B2強得多的黃光素，并可溶于氯仿。利用此性質可提高測定的靈敏度和選擇性。
⑤分子結構中存在ππ共軛的熒光物質在極性溶劑中，熒光效率顯著增強。溶液表面活性劑的加入能夠顯著提高熒光強度。
⑥瑞利散射和拉曼散射是溶劑的兩種散射光，應注意不要誤把瑞利散射和拉曼散射光譜當做熒光光譜。瑞利散射光波長與激發光波長相同，拉曼散射與激發光波長不同，而熒光物質的熒光波長與激發光波長無關，因此可以通過選擇適當的激發波長將拉曼散射光與熒光分開。在測試時選擇合適的狹縫寬度，或者空白扣除，也可以對散射光的影響進行校正。
⑦熒光物質分子與溶液中其它物質分子之問作用導致熒光強度降低，常見的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、O2、硝基化物質、重氮化合物等。溶液中的溶解氧也能引起幾乎所有的熒光物質產生不同程度的熒光熄滅現象，因此，在較嚴格的熒光實驗中必須除O2。
⑧測試過程中注意不要肉眼盯著氙燈光源看，以防對眼睛造成損傷。
⑨儀器房應注意經常通風，避免產生的臭氧在室內富集。
