蛋白質含量的測定：Folin-酚試劑法（Lowry法）和考馬斯...
蛋白質含量的測定—Folin-酚試劑法（Lowry法）和考馬斯亮藍法
1.學習Folin-酚法測定蛋白質含量的原理和方法。
2. 進一步掌握分光光度法——求標準曲線、準確測定未知樣品、正確使用儀器。
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原理
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蛋白質濃度可以從它們的物理化學性質，如折射率、比重、紫外吸收等測定而得知：或用化學方法，如定氮、雙縮脲反應、Folin-酚試劑反應等方法來求算。其中雙縮脲法和Folin-酚法是一般實驗室中經常使用的方法。它們操縱簡便、迅速，不需要復雜而昂貴的設備，又能適合一般實驗室的要求，若作一般的濃度測定較為適應。Folin-酚法靈敏度高，較雙縮脲法靈敏100倍。本實驗采用的是Folin-酚法。
Folin-酚法所用的試劑由兩部分組成。試劑甲相當于雙縮脲試劑，可與蛋白質中的肽鍵起顯色反應。試劑乙（磷鎢酸和磷鉬酸混合液）在堿性條件下極不穩定，易被酚類化合物還原而呈藍色反應（鉬藍和鎢藍的混合物）。由于蛋白質中含有帶酚基的酪氨酸，故有此顏色反應。因此，用Folin-酚法測定蛋白質含量靈敏度較高。
實驗步驟
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1. 標準曲線的制作：按下表操作
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| 管 號 |
BSA ? （300μg／mL） |
H2O |
Pr.含量 ? μg |
步 驟 |
|
1 ? 2? 3? 4? 5? 6 |
0 ? 0.2? 0.4? 0.6? 0.8? 1.0 |
1.0 ? 0.8? 0.6? 0.4? 0.2? 0 |
0 ? 50? 100? 150? 200? 250 |
各 試管加入試劑甲5.0mL，混合后放置10分鐘，加入試劑乙0.5mL，立即混合，37度恒溫反應20分鐘。以1號為參比，測A750的值。 |
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2. 樣品（小白菜）液的提取
稱取小白菜1-4克（菜桿2-4克，菜葉1-2克）置于研缽中，加 5mL蒸餾水在低溫下研磨成勻漿，全部轉移至50mL容量瓶中，并定容至刻度，然后抽濾，在3000rpm離心20分鐘，上層清液為提取液，待用。
<!--[if !supportLists]-->3. <!--[endif]-->樣品的測定
吸取提取液和稀釋250倍的血清液各1.0mL于試管中（三次重復），分別加5.0mL試劑甲，放置10分鐘后，加試劑乙0.5mL，立即混勻，恒溫37度反應20分鐘，測A750的值。
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| 管 號 |
小 白 菜 ? T 或 A |
管 號 |
血 清 ? T 或 A |
|
1 ? 2? 3 |
1 ? 2? 3 |
?
?
☆ 小白菜用mg／g， 血清用mg／mL。
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二 考馬斯亮藍法（1976年）
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原理
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染料考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后引起染料最大吸收波長的改變，從465nm變為595nm，光吸收增加，蛋白質-染料復合物具有高的消光系數，因此大大提高了測定蛋白質的靈敏度（1ug）
實驗步驟
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1.求標準曲線方程：按下表配置，操作。
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| 管號 |
BSA
? （150μg／mL） |
H2O
? （mL） |
考馬斯亮藍
? G-250（mL） |
Pr.含量 操 作 |
|
1
? 2? 3? 4? 5? 6 |
0
? 0.1? 0.2? 0.4? 0.8? 1.0 |
1.0
? 0.9? 0.8? 0.6? 0.2? 0 |
5.0
? 5.0? 5.0? 5.0? 5.0? 5.0 |
0 室
? 10 溫? 20 放? 40 置? 80 五? 100 min |
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2. 樣品pr.含量的測定
吸取小白菜提取液0.5mL，加入 蒸餾水0.5mL（三次重復）；吸取血清（稀釋500倍）1.0mL（三次重復），向以上各管加入考馬斯亮藍G-250 5.0mL，室溫放置5分鐘，測A595的值（一小時內完成）。
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| 管 號 |
小 白 菜
? T 或 A |
管 號 |
血 清
? T 或 A |
|
1
? 2? 3 |
1
? 2? 3 |
?
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☆ 小白菜用mg／g，血清用mg／mL。
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要求r≥0.99
