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安捷倫科技（中國）有限公司
氨基酸作為蛋白質的基本單元，是人體生理功能的必需物質，氨基酸的檢測在制藥、食品、環境都有重要的意義。在實驗室對氨基酸進行液相分析時，由于多數氨基酸極性大、缺少紫外吸收，為提高分析檢測靈敏度與分離選擇性，通常需要對氨基酸進行衍生后再分析。《中華人民共和國藥典》（2020年版）第一增補本中新增“9120氨基酸分析指導原則”中收錄了4種柱前衍生方法，其中PITC、AQC、DNFB衍生均需手動完成，過程繁瑣，OPA和FMOC衍生氨基酸測定法可于自動進樣器中實現自動衍生，OPA衍生一級氨基酸，FMOC衍生二級氨基酸。該方法采用兩個波長測定，338nm測定一級氨基酸衍生產物，262nm測定二級氨基酸（脯氨酸）衍生產物。本方法使用OPA和FMOC衍生試劑，Chromai自動進樣器在線衍生功能，可實現氨基酸的在線自動化衍生，大幅提升了氨基酸分析檢測效率。
儀器系統：
Chromai Leaps系統（四元泵P40、自動進樣器A10CV、柱溫箱C10、紫外檢測器D10）
標準品溶液：
氨基酸混合標準品溶液（天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸）
衍生試劑：
OPA：稱取40 mg鄰二苯甲醛，加入硼酸鹽緩沖液3.5 mL、乙腈0.5 mL、3-巰基丙酸64 μL，溶解并混合均勻
FMOC：稱取40 mg FMOC，加入乙腈8 mL，溶解并混合均勻
色譜條件：
流動相A：0.05 mol/L乙酸鈉溶液-三乙胺-四氫呋喃（950: 0.14: 5，用2 %乙酸調pH至6.8）
流動相B：0.16 mol/L乙酸鈉溶液（用2 %乙酸調pH至6.8）-甲醇-乙腈（200: 400: 400）
洗脫梯度: 0-27 min A相92%-40%; 27-31 min A相40%-0%; 31-38 min A相0%; 38.01-41 min A相92%
色譜柱：Chromai C18（4.6*250 mm, 5 μm）
流速：1 mL/min
柱溫：40 ℃
進樣體積：20 μL
檢測波長：338 nm（0-27min）; 262 nm（27-41min）
自動進樣器柱前衍生程序：
步驟 | 內容 |
1 | 吸取硼酸鹽緩沖液40 μL |
2 | 吸取待測樣品10 μL |
3 | 吸取OPA衍生液10 μL |
4 | 在樣品瓶混合5次 |
5 | 吸取FMOC衍生液10 μL |
6 | 在樣品瓶混合5次 |
7 | 吸取稀釋液120 μL |
8 | 在樣品瓶混合10次 |
結果與討論
如圖1所示，15種氨基酸經過OPA和FMOC衍生后，各峰均分離良好。
圖1 氨基酸柱前自動衍生標準溶液色譜圖
標準曲線與重復性：
在5-100 μg/mL的濃度范圍內，15種氨基酸線性良好，線性相關系數均大于0.999。
選取100 μg/mL濃度，重復進樣6針，峰面積和保留時間的重復性如表1和表2所示。
表1 氨基酸標準曲線線性結果
組分 | 線性方程 | r2 |
天冬氨酸 | y = 2.6486 x - 1.5526 | 0.9999 |
谷氨酸 | y = 2.1444 x - 4.2082 | 0.9999 |
絲氨酸 | y = 3.0669 x - 0.9696 | 0.9999 |
組氨酸 | y = 0.8647 x - 0.3588 | 0.9999 |
甘氨酸 | y = 3.5035 x - 4.1195 | 0.9998 |
蘇氨酸 | y = 2.7598 x - 0.8775 | 1.0000 |
精氨酸 | y = 1.9488 x - 0.8450 | 0.9999 |
丙氨酸 | y = 3.8840 x - 1.5092 | 0.9999 |
纈氨酸 | y = 2.9139 x - 0.6303 | 1.0000 |
蛋氨酸 | y = 2.2942 x - 0.3111 | 0.9999 |
苯丙氨酸 | y = 2.0334 x - 0.0421 | 1.0000 |
異亮氨酸 | y = 2.5605 x - 1.2149 | 0.9999 |
亮氨酸 | y = 2.6490 x - 0.3133 | 1.0000 |
賴氨酸 | y = 1.8708 x - 4.7725 | 0.9996 |
脯氨酸 | y = 3.9281 x + 15.2049 | 0.9997 |
表2 氨基酸保留時間和峰面積重復性結果（100 μg/mL）
組分 | 保留時間min RSD(%) | 峰面積mAU.s RSD(%) |
天冬氨酸 | 0.06 | 1.36 |
谷氨酸 | 0.08 | 1.12 |
絲氨酸 | 0.03 | 1.26 |
組氨酸 | 0.03 | 1.43 |
甘氨酸 | 0.03 | 0.96 |
蘇氨酸 | 0.02 | 1.24 |
精氨酸 | 0.04 | 1.27 |
丙氨酸 | 0.03 | 1.18 |
纈氨酸 | 0.01 | 1.23 |
蛋氨酸 | 0.01 | 1.23 |
苯丙氨酸 | 0.01 | 1.39 |
異亮氨酸 | 0.01 | 1.08 |
亮氨酸 | 0.01 | 1.20 |
賴氨酸 | 0.01 | 1.98 |
脯氨酸 | 0.04 | 4.14 |
結論
使用Chromai Leaps系統自動進樣器標配的柱前衍生功能，選擇OPA和FMOC兩種衍生試劑，可實現一級和二級氨基酸的在線自動化衍生。本實驗中15種氨基酸均可完全分離，線性和重復性測試結果優異，顯著提升了氨基酸分析的準確性和檢測效率。
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科諾美（英文：Chromai），是中國領先的從事分析檢測儀器與醫療診斷研發、生產、銷售和服務的高科技技術企業。是中國儀器儀表學會、中國分析測試協會、中國醫療器械行業協會會員。公司旗下設立北京研發中心、蘇州供應鏈中心等多家子公司。科諾美是國家高新技術企業，北京市“專精特新”企業，擁有國際水準的先進技術，擁有眾多核心的專利技術，自主知識產權。公司以振興民族產業為己任，堅持自主研發、持續創新，讓分析檢測更高效精準且易用，讓中國創造享譽全球，成為推動世界和人類健康安全進步的中國科技公司。科諾美專注于科學儀器與自動化和智能化的充分結合，基于自主研發、國產化自主可控和核心關鍵技術、擁有目前中國領先的超高效液相色譜核心技術（UHPLC），面向于化學分析與生命科學領域、精準醫療與臨床檢驗領域，為客戶提供全面多樣、領先可靠的儀器產品、試劑耗材、方法開發、服務產品等全流程解決方案，致力于不斷提升效率、降低分析成本，為客戶創造價值。
