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網絡藥理學專題 | IF14！中藥代謝組+網絡藥理學研究牛樟芝治療肝癌

邁維代謝

2023.2.03

?前言

網絡藥理學的研究自2020開始一直處于火熱的階段，同時也因為其簡單易操作帶來了許多問題，而為了保證網絡藥理學的健康發展，由世界中醫藥學會聯合會網絡藥理學專業委員會、清華大學主持制訂了國際第一部《網絡藥理學評價方法指南》，也一定程度上規范了未來網絡藥理學的研究內容，既然如此，我們就一起來看一下，在指南下的如何通過結合網絡藥理學的研究發表高分期刊，獲取可靠的研究結果。

牛樟芝通過在體外和體內靶向PI3K/AKT 介導的細胞周期進程發揮抗肝癌作用

●期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B

●IF：14.903

●發表時間：2021.7

研究背景

肝細胞癌(HCC)被認為是最常見的肝癌亞型，是全球癌癥相關死亡率的第四大原因，這不僅是由于其高擴散、轉移和復發率，而且還由于治療效果。目前，多種藥物，如索拉非尼和瑞戈非尼，均能提高HCC患者的總體生存率。然而，這些藥物存在一些問題，包括作用時間短、耐藥性等問題。因此，尋找安全、高效、低毒、逆轉耐藥的新藥迫在眉睫。

作為補充和替代醫學的主流形式，中醫藥（TCM）因其有益的效果和沒有嚴重的副作用而被癌癥患者廣泛接受。牛樟芝是一種稀有菌類，生長于中國臺灣，分布于海拔200-2000?m的闊葉林中。藥理研究表明，牛樟芝具有抗腫瘤、保肝、免疫調節、抑制血管新生內膜形成、降低血壓和膽固醇、抑制血小板聚集等生理活性。在眾多功能中保肝作用，尤其是抗HCC是最常報道的。牛樟菌可以降低HCC 細胞活力、增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡。然而，尚未闡明牛樟菌在抗 HCC中的主要作用和機制。

如今，牛樟芝以發酵酒或純培養的粉末、片劑、滴丸和膠囊的形式在市場上銷售，并逐漸成為臺灣最受歡迎的保肝劑和保健品之一。最近的研究表明，牛樟芝含有多種生理活性化合物，包括萜類、腺苷、有機鍺、微量元素、蛋白質、麥角甾醇、維生素、煙酸、核酸凝集素、甲殼素、木質素等。然而，目前有關牛樟芝化學指紋圖譜的報道較為零散，缺乏系統研究。此外，對牛樟芝的研究主要集中在單個成分的治療效果或定量分析上。從整體的角度來看，全面的化學指紋以及化學成分、分子靶點、信號通路和抗HCC 活性之間的相關性仍然難以捉摸。

研究思路

研究結果

1.?牛樟芝的化學成分鑒定及靶點收集分析

通過代謝組學技術手段共鑒定到139個物質，包含102個萜類、8個苯環型、2個嘌呤核苷酸和22個其他類。

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圖1?antcin A物質鑒定結果

對ACDPs中鑒定得到的成分利用SWISS ADME數據庫篩選用于下一步的靶標預測分析的成分，篩選的成分必須滿足兩個條件：首先，胃腸道吸收（GI absortion）設置為“HIGH”作為藥物吸收的條件，用于篩選具有良好口服生物利用度的活性化合物。其次，在五種預測性質（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中具有“YES”的兩種或多種化合物可以被視為活性成分。其中有72種活性成分具有高胃腸道吸收和適當的藥物相似性。

對滿足篩選條件的成分使用Swiss TargetPrediction 用于預測化合物的靶標，篩選條件設定為可能性>0.12；同時，從NAPSS數據庫中下載了關于ACDPs已驗證目標的信息，與前面得到的靶標信息進行合并，并構建成分-靶標網絡（圖2A）。然后，對整合的目標進行GO和KEGG的富集分析（圖2B、C）。GO富集分析表明，ACDPs的靶點與ERK1和ERK2級聯的正調控，炎癥反應、凋亡過程的負調控，細胞增殖的正調控等密切相關（圖2B）。KEGG通路富集分析表明，ACDPs的靶點在癌癥、乙型肝炎、FoxO信號通路、胰島素抵抗等通路中顯著富集（圖2C）。

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圖2?牛樟芝成分-靶點網絡圖及靶點GO/KEGG富集分析

2.?肝癌疾病靶點（標志物）預測

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圖3?肝癌靶點預測流程及結果

1.利用登錄在GEO上的肝癌相關基因表達數據進行分析

在GSE14520、GSE45267、GSE64041和GSE112790的數據集中總共獲得了514個HCC樣本和341個正常樣本。如圖4A-D 所示，PCA的結果表明，每個樣本中的腫瘤和正常組織樣本數據集來自不同人群，說明樣本來源可靠。然后，在ggplot2可視化后，limma包分析差異表達基因（DEGs）的熱圖如圖4I-L所示。聚類熱圖結果證明，DEGs可以區分腫瘤組織和正常組織，因此DEGs可以代表整個樣本。接著通過Robust Rank Aggreg (RRA)整合DEG，獲得293個DEG，包括120個上調基因和173 個下調基因（圖4M）。DKK1、REG3A、DEFB1、MMP12和LCN2是前五位上調基因，而STAB2、CLEC1B、CXCL14、FCN3和ASPM是前五位下調基因。

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圖4?GEO獲得的肝癌表達數據分析

(A)-(D) GSE14520、GSE45267、GSE64041和GSE112790的PCA圖。 (E)-(H) GSE14520、GSE45267、GSE64041和GSE112790中DEG的火山圖。(I)-(L) GSE14520、GSE45267、GSE64041和 GSE112790中DEG的熱圖。(M) TOP 20上調和下調DEG的熱圖。

2.利用GEO得到的差異表達基因，進一步在TCGA 數據庫中繼續篩選。

TCGA數據庫中包含374個HCC組織和50個正常組織。生存分析表明，來自HCC患者的113個DEG與總生存率（期）顯著相關。ROC分析顯示，來自HCC患者的41個DEG與腫瘤的識別顯著相關。在LIHC中，對總生存率（期）有顯著影響的DEGs是AURKA、CCNB1、細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）、SUMO激活酶亞基1（SAE1）和拓撲異構酶IIα（TOP2A），這些基因的相應ROC曲線展示在圖5。通過結合對總生存率（期）和腫瘤鑒定具有重要意義的LIHC結果，獲得了與HCC密切相關的41個DEG（41個上調基因）。

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圖5?靶標生存分析和ROC分析

3.DisGeNET數據庫獲取肝癌靶標

在DisGeNET數據庫中有5725個與HCC相關的條目。通過將閾值設置為0.5，收集了40個HCC靶標。最后通過合并這些靶標，獲得了79個HCC的靶標（生物標志物）。

3.?網絡分析

將通過成分預測的靶點和疾病預測的靶點進行交叉分析，獲得ACDPs中與HCC相關15個靶標（圖6A）。然后將這些靶標使用STRING數據庫和Cytoscape建立了蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡。基于此，使用了MCODE計算PPI網絡中具有特殊功能的模塊的插件。篩選模塊化分析得分≥4，共收集到CCNB1、CASP8、CCNE1、CDK1、PIK3CA、MET、AURKA、TOP2A和TERT等9個靶點。這些靶點的KEGG通路富集分析表明，它們顯著富集了磷酸肌醇3激酶（PI3K）/AKT和細胞周期信號通路，例如癌癥通路、病毒致癌通路和P53信號通路（圖6B）。

同時，利用篩選得到的靶標與ACDP的活性成分建立成分-靶標網絡圖（圖6C）。然后，使用分子對接方法來預測ACDP生物活性化合物與相應靶蛋白之間的相互作用。結果zhankuic acid E 與CDK1、PIK3CA和CCNE1具有潛在的高結合親和力，靈芝醇B與CDK1和PIK3CA具有潛在的高結合親和力，靈芝酚與CCNE1具有潛在的高結合親和力，靈芝酚A具有與TERT的潛在高結合親和力等等。活性化合物和蛋白質的三維和二維結合模式如圖6D和E。綜合起來，這些結果表明ACDPs可能通過降低細胞表達PI3K/AKT信號級聯調節的循環相關蛋白而發揮抗肝癌作用。

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圖6?成分-靶點-通路網絡圖構建及分子對接分析

4.?驗證實驗

1.體外實驗

為了進一步驗證ACDPs對HCC細胞的影響，利用體外培養人肝癌細胞系HepG2、Huh-7和SMMC-7721進行實驗。

首先，使用細胞計數實驗CCK-8測定法檢查了ACDPs對細胞活力的影響。用不同濃度（0、0.4、0.8、1.6和3.2 mg/mL）的ACDP預處理細胞24或48小時。結果表明用ACDP處理細胞劑量和時間依賴性地抑制HCC細胞的活力（圖7A-C）。然后，同時利用平板克隆形成實驗進一步證明了ACDPs在體外具有合理的抗肝癌作用（圖7D），與CCK-8測定的結果一致。此外，通過細胞增殖實驗EdU 測定證實了ACDP的抗增殖作用（圖7E-G）。

其次根據信息學結果，ACDPs可能通過調節PI3K/AKT通路影響細胞周期相關蛋白的表達。Western blot檢測Huh-7細胞cyclin E1和CDK1的表達。如圖7H所示，在ACDPs刺激后它們顯著減少。除此之外還發現，在ACDPs刺激下，cleaved-caspase 8的表達增加。同時，ACDPs降低了PIK3CA的表達和AKT的活性。總之，ACDPs可以通過PI3K/AKT信號通路在肝癌中發揮抗癌作用。

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圖7?體外實驗驗證

2.體內實驗

為進一步驗證ACDPs的抗腫瘤作用并探索其體內可能機制，建立了BALB/c小鼠HCC模型。

與模型組相比，ACDPs以劑量依賴性方式抑制小鼠腫瘤生長（圖8A和B）。給予200和400 mg/kg/天ACDPs后，腫瘤重量分別減少了48%和67%，并且顯著減少了腫瘤體積（圖8C和D）。同時統計了各組小鼠的體重變化曲線，表明ACDPs沒有明顯的毒副作用。

免疫組化染色檢測相關蛋白的表達水平和PI3K/AKT信號通路的活性。cyclin E1、CDK1、PIK3CA、p-AKT和AKT的表達水平顯著降低，而cleaved-caspase 8的表達水平升高（圖8E）。總之，這些數據表明，ACDPs誘導的細胞增殖抑制與誘導細胞周期停滯和阻斷PI3K/AKT信號通路相關。

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圖8?體內實驗驗證

本文亮點

1.本研究首先依賴于代謝組學技術手段，對中藥單方中的成分進行鑒定，獲得可靠的成分數據，這一步為后續的數據分析奠定了重要的基礎，也從根本上避免“同質化”的問題。相較于只從目前中藥數據庫中獲取成分信息，既可以避免出現“異病同治”這種篩選到在中藥中普遍存在的物質，也可以為中藥質量標志物Q-Marker選到在牛樟芝中的藥效特有物質。

2.其次，本研究相較于以往的網絡藥理學研究，在疾病靶點篩選中，同時利用已有的基因表達數據，能輔助在網絡圖構建中縮小需要重點關注的靶點數目；

3.最后，利用體內外實驗對生物信息分析的結果進行驗證，驗證結果也表明分析的方向和結果是無誤的，對于后續利用網絡藥理學研究不僅建立了極大的信心，同時也可以推動中藥方證藥理學的發展。

本文整體的研究思路也符合由世界中醫藥學會聯合會網絡藥理學專業委員會、清華大學主持制訂了國際第一部《網絡藥理學評價方法指南》，也給了我們學習的思路。

中藥代謝組-網絡藥理學-驗證實驗研究解決方案：

除了學習到這篇文章中利用代謝組學技術手段來對中藥成分進行鑒定，我們也可以同樣通過利用中藥飲片道地差異的成分來輔助藥效成分篩選，這一方法同樣適用于中藥復方進行成分獲取。藥效成分獲取的越準確，越有利于后續進行靶點預測，最終也會決定藥效機制的闡述。