分析測試百科網 > 行業資訊 > 微信文章

For Better PROTACs：蛋白質組學在藥物研發中的應用

中科新生命蛋白代謝多組學

2022.9.08

小編的上一篇文章為大家介紹了PROTAC的技術原理和最新行業進展（小分子創新藥的又一春？--PROTACs藥物研究系列之一），這一篇文章則主要討論醫藥同仁們在PROTAC藥物研發中的遇到的挑戰和可能的解決方案。

PROTAC行業經歷了20年的發展，成功從概念驗證過渡到實際應用階段，但仍有許多問題和挑戰亟需解決。

目前最主要的挑戰來自于2個方面：

1)分子設計和成藥性優化，包括小分子配體的設計、新型E3配體的設計、linker的設計、分子量過大導致的透膜性和生物利用度差、hook效應等；

2)分子的生物活性評價，包括高通量分子篩選、PK/PD評估、降解活性、脫靶效應等。

尤其PROTAC特異性的藥效評價及脫靶效應帶來的毒性風險，成為PROTAC藥物研發亟待突破的“關鍵瓶頸”。

定量蛋白質組學

評估PROTAC脫靶效應的有力工具

不論是RNAi、細胞治療、小分子靶向藥，還是PROTAC技術，由脫靶效應所導致的細胞毒性都是需要重點關注的問題。但考慮到基因靶向藥和小分子抑制劑等都只是對蛋白活性進行抑制，殘留的蛋白活性也可以支撐細胞和器官的基本生理功能，如此便可降低潛在毒性。但PROTAC藥物是直接對靶蛋白進行完全降解，一旦脫靶便會讓蛋白徹底失活，由此帶來的細胞毒性和潛在風險就大得多。

脫靶效應帶來的細胞毒性在臨床前的安全性評價試驗和毒性篩選試驗中并不易被發現和檢測到，由此也增加了藥物后期開發的風險。

2010年，日本學者終于發現半個世紀前導致“海豹兒”事件的沙利度胺的致畸原理，在于這一藥物會和與 Cullin RING E3 泛素連接酶?CUL4-RBX1-DDB1-CRBN (CRL4CRBN)?結合并促進關鍵靶點，如鋅指 (ZnF) 轉錄因子 IKAROS (IKZF1)、AIOLOS (IKZF3) 和ZFP9的泛素化，進而導致這些蛋白的降解。基于此，諾華公司研發負責人James Bradner在2015年的《Science》刊登了基于沙利度胺類似物結構的新一代PROTAC分子，引起業界轟動，CRBN E3酶受體也成為了現下使用頻率最大的PROTAC分子骨架之一[1]。但沙利度胺的生殖毒性也警醒研究者對PROTAC的毒性評價工作必須更加謹慎客觀。當分別使用沙利度胺及其衍生物來那度胺和泊馬度胺對胚胎干細胞進行處理(圖1)[2]，用Mass Spectrometry-Based的蛋白質組學技術對藥物處理后的細胞系內近1萬種蛋白進行高通量定量分析，發現除了既定靶標SALL4蛋白豐度出現明顯下降外，還有多個其他蛋白（FAM83F, RAB28, CSNK1A1， ZBTB39, ZFP91，DTWD1和WIZ)也出現了不同程度的降解。而這一脫靶現象在使用不同細胞系進行相同的藥物處理時均有發現。且在不同的細胞系中，脫靶蛋白的種類、數量和豐度都有所不同。因此，在PROTAC分子骨架設計時，不論是使用CRBN配體，還是使用其他E3酶配體，都需要對其潛在的脫靶蛋白進行前置分析。而定量蛋白質組學可以對細胞系內六千種以上蛋白進行全局高通量、高靈敏度的鑒定與定量分析，最大程度發現藥物作用后細胞的響應位點和影響范圍，是PROTAC分子脫靶分析的有力工具。

圖1：對沙利度胺/來那度胺/泊馬度胺處理后的細胞系進行基于定量蛋白質組學的脫靶分析[2]

泛素化蛋白質組學

綜合評估泛素化位點和降解特異性

PROTAC藥物一個重要的應用方向是，基于E3連接酶的腫瘤/細胞/組織特異性，實現PROTAC的精準靶向蛋白降解（precision TPD）。如目前應用較多的VHL E3連接酶，在人血小板中的表達量很低，但在多種人類腫瘤細胞中均檢測到VHL的高水平表達，利用VHL E3酶的這種“反向特異性”，可以將具有劑量限制毒性的抗腫瘤藥物轉化為組織特異性、毒性較低的PROTAC分子。由美國制藥企業艾伯維公司(AbbVie)研發并上市的ABT199是一種新型BCL-2抑制劑，但是，可以同時抑制BCL-2和BCL-XL的雙抑制劑ABT263卻因為對BCL-XL的靶向毒性會殺死血小板細胞、導致劑量限制性血小板，而無法上市。為了開發能夠抑制BCL-XL活性、但又不會對血小板產生毒性的抗腫瘤藥物，一篇刊登在《Nature medicine》的文章中描述了一種經VHL招募彈頭融合ABT263而成的PROTAC分子（DT2216），不僅抗腫瘤活性高于ABT263,更可大大降低血小板的毒性(圖2，A)[3]。

為了驗證DT2216的細胞特異性，研究者使用細胞培養條件下穩定同位素標記技術 (SILAC)?和基于液相色譜-串聯質譜 (LC-MS/MS) 的蛋白質組學技術，分析經DT2216和DT2216NC（不能和VHL結合的陰性對照組化合物）處理后細胞中蛋白質的變化。SILAC/LC-MS/MS結果顯示（圖2）， DT2216可以顯著降低BCL-XL的蛋白豐度，但這兩種藥物均不影響任何其他蛋白質的表達，證明DT2216的確是一種特異性BCL-XL PROTAC。

為了進一步確認泛素化的位點，利用泛素化蛋白質組學對BCL-XL內的特異性泛素化位點進行檢測。將293T 細胞與 Flag-BCL-XL 和 HA-泛素載體進行共轉染，利用抗Flag親和樹脂對提取物進行免疫沉淀，然后用胰蛋白酶和AspN酶進行水解消化，隨后對降解后的修飾肽段富集，用Tandem Mass Spectrometry進行檢測分析。圖2為BCL-XL的泛素化肽EVIPMAAVKQALR的片段化圖譜，通過對其一級和二級圖譜的分析，可以確定BCL-XL蛋白的泛素化位點為 Lys 87 殘基。

圖2：基于泛素化蛋白質組學對DT2216的細胞特異性和BCL-XL的泛素化位點進行分析[3]

由此，基于Tandem Mass Spectrometry平臺的泛素化蛋白質組學，可以精準確定靶蛋白或疑似脫靶蛋白上發生修飾的肽段及其修飾位點，對其泛素化水平進行評估，確認基于E3酶的藥物作用機制。

行業展望

PROTAC技術的面世，為小分子創新藥行業帶來了新的春天，尤其是在針對“不可成藥”靶點和“耐藥性”方面，更是被寄予極大的期望。目前尚未有任何一款PROTAC分子藥物面世，研發過程中也還存在著許多技術挑戰，但目前取得的初步成果依舊令大家對這一新興技術和治療策略充滿希望，也令這一行業成功受到資本市場的追捧。我們期待越來越多設計巧妙、滿足臨床需求的PROTAC分子的面世，使得更多的患者受益、更多的疾病得到有效治療。

參考文獻

[1] GEORG E. W, DENNIS L. B. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation [J]. Science, 2015.

[2] DONOVAN K A, AN J, NOWAK R P, et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome [J]. Elife, 2018, 7.

[3] KHAN S, ZHANG X, LV D, et al. A selective BCL-XL PROTAC degrader achieves safe and potent antitumor activity [J]. Nat Med, 2019, 25(12): 1938-47.

# 服務咨詢 #

中科新生命提供基于高分辨質譜蛋白質組學和生物信息學的小分子藥物篩選解決方案，可實現PROTAC藥物的脫靶蛋白檢測、降解蛋白泛素化位點分析和生物功能影響分析等藥物全景分析。