空間代謝組專題 (二)：最全的基質(zhì)選擇指南

邁維代謝

2022.8.10

前言

通過空間代謝組專題(一)：最全的樣本準(zhǔn)備操作指南（點開即可查看），了解了樣本怎么準(zhǔn)備，那么接下來最重要的步驟就是基質(zhì)噴涂了。基質(zhì)是與待測物共結(jié)晶存并吸收激光能量以防止激光直接照射破壞待測物。待測樣品分散在基質(zhì)中，基質(zhì)有效地吸收一定波長的脈沖激光的能量，然后均勻地傳輸?shù)綐悠分校箻悠匪查g蒸發(fā)并離子化。大量的基質(zhì)有效地分散了待測樣品，從而減少了待測樣品分子間的相互作用。

基質(zhì)的選擇是MALDI分析中最重要的步驟之一。理想的基質(zhì)通常具有以下特性：在所使用的激光波長下具有強(qiáng)電子吸收性，較好的真空穩(wěn)定性，較低的蒸氣壓以及與固態(tài)分析物的良好混溶性。

那么該如何選擇什么基質(zhì)呢？基質(zhì)的選擇主要取決于所用激光的波長，其次是待測物的性質(zhì)。通常，高極性分析物在高極性基質(zhì)中更好，非極性分析物最好與非極性基質(zhì)結(jié)合使用。下面我們先通過一篇文章看一下基質(zhì)選擇（太長不想看也可以直接翻到最后有常用基質(zhì)總結(jié)）。

?●?發(fā)表期刊：analytical chemistry

?●?影響因子：6.785

?●?發(fā)表時間：2020.04

設(shè)計并合成了一系列新型鄰氨基苯甲酸衍生物（I-IV），其中COOH-NH2（I）和COOH-NHMe（IV）具有酸和堿的雙官能度，用于生物樣品（尤其是脂質(zhì)）的基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜（MALDI- TOF）成像。在標(biāo)準(zhǔn)的355 nm激光激發(fā)下，系統(tǒng)地研究了I-IV質(zhì)子化，去質(zhì)子化和質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熱量，以及在正離子和負(fù)離子模式下分析生物分子的能力。結(jié)果表明雙極性和酸堿性質(zhì)之間的相關(guān)性。此外，COOH-NHMe（IV）顯示出獨特的性能，并成功地用作MALDI-TOF質(zhì)譜成像（MSI）的基質(zhì)，用于研究小鼠的大腦。結(jié)果表明，與商業(yè)基質(zhì)相比，COOH-NHMe（IV）在檢測更多脂質(zhì)和蛋白質(zhì)種類方面具有優(yōu)越性。此外，獲得了脂類分布的MALDI-TOF MSI結(jié)果，使COOH-NHMe（IV）成為了潛在的下一代通用基質(zhì)。

試劑：2,5-DHB；1,5-DAN；芥子酸（SA）；CHCA；9-AA；2''，5''-二羥基苯乙酮（2,5-DHAP；2''，6''-二羥基苯乙酮（2,6-DHAP）；PC（14：0/14：0），PE（14：0/14：0），PA（14：0/14：0），PS（14：0/14：0）和磷脂酰甘油PG（14：0 / 14：0）；萃取溶劑甲醇（MeOH），乙腈（ACN），氯仿和乙酸乙酯（EA）。

樣本：小鼠大腦，12μm切片厚度。

基質(zhì)合成方法

基質(zhì)合成路線如下圖，市售的COOH-NH2（I）是合成的初始反應(yīng)物，首先用氫化鋁鋰LAH還原COOH-NH2（I），然后與MnO2進(jìn)行氧化反應(yīng)，生成醛CHO NH2（II）。然后將CHO-NH2（II）修飾為乙酰胺衍生物CHO-NHAc（III）。同時，COOH-NH2（I）氨基上的一個H被烷基（-CH3）取代以獲得衍生物COOH-NHMe（IV）。本研究采用的反應(yīng)簡易，且以高產(chǎn)率（> 50％）生成目標(biāo)分子。

■?■■■■

基質(zhì)合成路線

不同基質(zhì)比較

通常，正離子為質(zhì)子化如鈉離子或鉀離子（[M + H] +，[M + Na] +和[M + K] +），負(fù)離子為去質(zhì)子化離子（[MH]-）。因此，為了量化合成基質(zhì)的可行性，基于密度函數(shù)理論（DFT）進(jìn)行理論計算，以獲取相應(yīng)的質(zhì)子親和力（PA）和去質(zhì)子化能量（DE），其值可以了解分別產(chǎn)生[M + H] +和[MH]-的趨勢。在合成基質(zhì)中，COOH-NHMe（IV）表現(xiàn)出相對較高的PA和較低的DE，因此有望在正負(fù)兩種模式下成為合適的基質(zhì)，可與僅適用于正或負(fù)離子模式的商業(yè)基質(zhì)相比較，顯示出其在實際基質(zhì)應(yīng)用中的巨大潛力。

不同基質(zhì)密度函數(shù)理論計算比較

■?■■■■

不同基質(zhì)脂質(zhì)和蛋白強(qiáng)度對比

將合成基質(zhì)與一些最具代表性的商業(yè)基質(zhì)進(jìn)行比較，如下圖，每一列為脂質(zhì)或蛋白質(zhì)，每一行為一種基質(zhì)，紅色表示正離子模式，藍(lán)色表示負(fù)離子模式，顏色越深表示相對信號強(qiáng)度越大。與其他基質(zhì)相比，COOH NHMe（IV）作為基質(zhì)分析的脂質(zhì)顯示出最高的信號強(qiáng)度，且不管是正離子模式或是負(fù)離子模式蛋白質(zhì)豐度也較高。其次是用于脂質(zhì)檢測的1,5-DAN。2,5-DHB和CHCA負(fù)離子豐度較低，通常用于正離子檢測中，9-AA和1,5-DAN適用于負(fù)離子檢測。

■?■■■■

不同基質(zhì)脂質(zhì)和蛋白強(qiáng)度比較

質(zhì)譜成像評估

為了證明COOH-NHMe（IV）可以檢測脂質(zhì)分布，將其用作小鼠冠狀大腦切片MALDI-TOF MSI的基質(zhì)。在正離子模式下，磷脂酰膽堿PC（36：1）主要分布于大腦白質(zhì)，而PC（32：0）主要分布于灰質(zhì)中，與使用其他基質(zhì)的先前報道相符。在負(fù)離子模式下，磷脂酸PA（34：1），磷脂酰乙醇胺PE（36：1），磷脂酰絲氨酸PS（36：0），磷脂酰肌醇PI（38：4）主要分布于灰質(zhì)中，二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺DMPE（34：1p）和磷脂酰甘油PG（40：6）主要分布于白質(zhì)中。因此，可以通過MALDI TOF MSI成功地在一個實驗中同時獲得帶有正離子和負(fù)離子的脂質(zhì)的非靶向分子成像。盡管由于設(shè)備的限制，大多數(shù)測試限制在空間分辨率80 μm真空2小時，但該基質(zhì)有可能能夠執(zhí)行高空間分辨率成像，有可能實現(xiàn)5 μm 空間分辨率質(zhì)譜成像。

■?■■■■

質(zhì)譜成像評估結(jié)果

該研究合成了一系列新的鄰氨基苯甲酸衍生物I-IV，其中COOH-NH2（I）和COOH NHMe（IV）具有酸/堿雙官能度，并證明了其在雙極性檢測中的潛力。其中，COOH-NHMe（IV）在激光激發(fā)下，在產(chǎn)生多種生物分子（包括脂質(zhì)和蛋白質(zhì)）離子方面表現(xiàn)出卓越效率。使用新合成的基質(zhì)，可以輕松獲得小鼠大腦切片中脂質(zhì)的高質(zhì)量分子成像。通過光物理和化學(xué)的更徹底和系統(tǒng)的研究，將很快實現(xiàn)MALDI質(zhì)譜成像的通用基質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

Huang P , ?Huang C Y , ?Lin T C , et al. Towards the Rational Design of Universal Dual Polarity Matrix for MALDI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2020.

針對不同的樣本類型和關(guān)注目標(biāo)，可能適用的基質(zhì)也不同。小分子代謝物和脂質(zhì)最常用的商業(yè)基質(zhì)總結(jié)如下表，在實際項目中會通過預(yù)實驗測試哪種基質(zhì)更合適，選擇對應(yīng)基質(zhì)進(jìn)行正式實驗。

常用基質(zhì)中文英文CAS

CHCA/HCCA

α-氰基-4-羥基肉桂酸

alpha-cyano-4-hydroxycinnamic?acid

28166-41-8

DHB

2，5-二羥基苯甲酸

2,5-dihydroxybenzoic?acid

490-79-9

1,5-DAN

1,5-二氨基萘