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抗體藥物LC-MS生物分析
抗體藥物LC-MS 法生物分析
本文來自于凡默谷藥學學報 Acta Pharmaceutica Sinica, 2020, 55(3): 453 ?462，由中國科學院上海藥物研究所的高宇雄, 鐘大放教授所著，若有侵權，請告知立刻刪除。
在抗體藥物的生物分析中, 液相色譜-質譜聯用(LC-MS) 技術已經成為傳統配體結合分析(LBA) 的一種重要的替代或補充方法。對抗體藥物LC-MS 法生物分析的進展進行綜述并有實際案例供參考。
01
LC-MS 技術分析抗體藥物的原理
自20 世紀90 年代末以來, LC-MS 一直是靈敏、準確和快速分析小分子藥物的有力工具。最近, 已經開發了各種LC-MS 技術來定量復雜生物基質中的蛋白質[15]。通過LC-MS 定量蛋白質, 可以在蛋白質的水解肽和完整的蛋白水平上進行。
對完整的蛋白直接進行質譜分析, 由于去除了酶解步驟, 可以使生物分析工作流程更快, 理論上還可以獲得更完整的數據[16,17]。但是受限于儀器, 當前基于LC-MS 的抗體定量研究絕大多數都是在肽水平進行的, 肽水平的定量可以提供更高的靈敏度、準確性和重現性。
對抗體的肽水平進行定量, 指的是將目標蛋白酶解之后, 對獲得的特征性肽段(signature peptide, SP)進行絕對定量(以穩定同位素標記類似物為內標)。這種以肽為中心的方法, 也被稱為自下而上法。
與大分子量的蛋白質相比, 肽具有更好的LC-MS 兼容性[18]。主要的原因有:
①? ? 肽段在質譜上的靈敏度遠遠高于蛋白質;
②? ?大多數MS 分析器的m/z 檢測上限比較低(<1 500), 無法分析相對較大的蛋白質的多電荷母離子, 而大多數肽段的m/z 可以很容易地被幾乎所有MS分析器檢測到;
③ 在體內環境中, 蛋白質通常會攜帶翻譯后的修飾, 這會改變蛋白質的質量并引入相當大的分析變異性, 而當在肽段水平上定量蛋白質時, 選定的肽段通常不會發生變化, 從而確保檢測分析的可靠度和重現性。
在肽段水平的定量檢測, 只需要在低分辨的三重四級桿質譜上即可實現。一般使用的是選擇反應監測(SRM) 或稱為多反應監測(MRM) 模式, 與小分子的質譜分析相似, 對肽段的母離子和碰撞產生的子離子進行兩次選擇。相較于LBA, LC-MS 具有更高的靈敏度、更好的定量準確度和更寬的定量動態范圍, 并且可以通過切換離子監測的通道, 在一次LC-MS 分析中定量多個分析物[19]。
由于肽段的母離子一般帶有多電荷, 在SRM模式下, 相同的m/z 可能指向的并不是同一個肽段, 由此受到了樣品中基質的干擾。而肽段被打碎之后, 其產生的碎片所帶電荷數變少, 子離子m/z 有可能大于母離子的m/z, 如果在定量分析時選擇這樣的離子對, 可以進一步的提高分析的選擇性和靈敏度。
例如Duan 等[11]在開發抗體的LC-MS 法時對肽段的離子對進行優化, 優先選擇子離子m/z 大于母離子的離子對
當MS 優越的選擇性與充分的LC 分離相結合時,LC-MS 便為復雜基質中蛋白質的定量提供了一種通用和強大的工具。LC-MS 法定量蛋白的基本流程包括: 樣品的純化或富集、目標蛋白的酶解、最后對確定的特征性肽進行檢測, 完成蛋白的定量。在這個過程當中, 與小分子的分析類似, 同樣用穩定同位素標記的類似物用作內標(IS), 以提高分析的準確度[20]。
以肽為中心自下而上定量目標蛋白, 已經成為目前最廣泛使用的LC-MS 分析策略。盡管如此, 該技術的發展仍然有其發展瓶頸。從最開始選擇合適的肽段開始, 優化酶解條件, 確保酶解的效率和重現性, 最后優化液質參數, 這些步驟都相對復雜和耗時, 由此限制了分析通量。除此之外, 酶解過程可能丟失完整蛋白質的必要信息。
以抗體為代表的蛋白質藥物, 生物轉化表現出比小分子藥物更多樣化的代謝途徑, 包括碳水化合物肝臟介導的清除、溶酶體代謝、抗體Fc 介導的清除(通過結晶化)、FcRn 結合與抗體的結合, 以及抗藥抗體介導的消除等[21]。而在水解肽的水平進行量化時, 肽序列僅部分體現蛋白質的信息, 丟失關于碳水化合物轉化和抗藥抗體相互作用的信息等。
02
LC-MS 技術在抗體藥物生物分析中的實例
血清/血漿中抗體的藥動學(PK) 研究
LC-MS 法已被廣泛應用于血漿/血清中mAb 的定量, 以支持臨床前和臨床PK研究。Hagman 等[54]開發了LC-MS 方法來定量食蟹猴血清和人血清中的模型抗體藥物。通過前處理將25 μL 血清樣品中約50%的血清總蛋白去除, 人和食蟹猴樣品中模型抗體的定量下限均可以達到2 μg·mL-1。Ouyang 等[15]則將顆粒內酶解與LC-MS 相結合, 用于猴子血漿中mAb 候選藥物的分析。
除此之外, 也有學者通過建立不同的LC-MS 法或LBA法來檢測同樣的抗體樣品, 對不同的分析方法進行全面的比較。例如Lu 等[55]分別采用白蛋白耗竭、蛋白A捕獲和抗體捕獲3 種前處理方式, 對mAb 候選物CNTO736 進行LC-MS 定量。
他們所得到的結論是這3種方法都為PK研究提供了足夠的靈敏度。FernándezOca?a 等[10]建立了LC-MS 方法定量人血清中的游離和總的抗MADCAM單抗, 游離mAb 由生物素化的抗獨特型抗體捕獲, 用鏈霉親和素磁珠富集, 總mAb 則通過蛋白G磁珠富集。
本實驗室最近建立了一種LBA 分析方法和兩種與不同前處理相結合的LC-MS 方法[29], 首次對大鼠和食蟹猴血清中抗CD47 的mAb 候選藥物(SHR-1603)進行定量。其中, LBA 法所使用的是MSD 電化學發光儀器, 通過形成“CD47-單抗藥物-標記性二抗”復合物, 檢測完整的單抗藥物, 測定范圍19.5 ng·mL-1～10 μg·mL-1。
LC-MS 法則使用了兩種不同的前處理方式: 沉淀顆粒內酶解, 用有機溶劑提取目標抗體, 然后對其進行酶解, 測定范圍250 ng·mL-1～500 μg·mL-1;磁珠親和富集后酶解, 用抗原CD47 包被的磁珠對樣品中的目標抗體進行免疫親和富集, 并在磁珠上完成后續的酶解, 最后都用同樣的質譜分析方法來檢測特征性替代肽段, 測定范圍為100 ng·mL-1～100 μg·mL-1。
3 種方法都成功應用于臨床前PK研究, 最后獲得了有顯著差異的PK曲線。
該研究表明3 種方法獲得的藥物濃度在低劑量組中顯示出很好的一致性(藥物暴露率的比值在1.05～1.11), 而在中劑量和高劑量組中, 使用LC-MS 方法測得的藥物濃度高于通過ECL方法獲得的藥物濃度, 這可能是由于所測的抗體形式不同(游離mAb 和總mAb)。LC-MS 方法對于SHR-1603的PK 評估顯示出較高的準確性、分析效率和成本效益。
如前文所述, 免疫親和富集與LC-MS 相結合的雜交分析方法, 可以提高抗體定量的靈敏度。這種方法也有助于測量生物基質中除抗體以外的靶標。比如通過將抗體藥物本身作為捕獲抗體, 用于定量猴和人血漿中存在治療蛋白的抗藥抗體。
此外, LBA也可以與LC-MS 平行使用, 例如, LBA和LC-MS 已經被應用于在抗體偶聯藥物(ADC) 的生物分析中, 測定ADC 藥物的藥物抗體比(DAR)[56]。ADC 藥物通過mAb 的靶向作用, 特異地傳遞所攜帶的小分子藥物。
DAR和藥物負荷分布是決定ADC體內療效和毒性的關鍵參數,DAR的微小變化會導致靶向部位暴露量的顯著變化。Xu 等[57]建立了檢測一種ADC 藥物的親和富集結合LC-MS 的分析方法, 成功測量了體外和體內的DAR。
盡管在過去的十幾年中, LC-MS 法定量抗體的研究蓬勃發展, 但用此方法獲得臨床PK數據并提交新藥研究申請和生物制品許可申請的例子非常少[58]。抗體藥物的生物分析試驗必須得到驗證, 以滿足監管的要求。蛋白藥物的LC-MS 分析應該遵循監管指南的哪些部分, 這一點在2018 年FDA頒布的《工業用生物分析方法驗證指南》中還未明確[59]。
美國藥學科學家協會(AAPS) 生物分析組的蛋白質LC-MS 生物分析小組, 在2015 年首次提出在蛋白質LC-MS 生物分析方法驗證過程中應該評估的方法參數和驗收標準, 為蛋白質LC-MS 生物分析方法的驗證提供一些基本原則[60]。該白皮書側重的是使用酶解得到替代肽的LCMS方法, 旨在支持非臨床毒代動力學和臨床藥代動力學研究。該白皮書認為, 由于大蛋白(如抗體) 分析的復雜性以及與LBA的結合, LC-MS 分析蛋白的接受標準相對于小分子LC-MS 應該適當放寬, 驗證精密度和準確度應設為20% (LLOQ為25%)。
組織中抗體的分布
研究抗體在組織中的分布情況, 對于評估抗體藥物的安全性和有效性有重要意義。盡管LC-MS 法已被廣泛應用于血漿/血清中mAb 的定量, 組織中的mAb 定量工作卻較少被報道。
與在血漿/血清中直接定量相比, 組織樣品需要額外的前處理, 開發組織樣品提取、清理和酶解的最佳方式。由于抗體的分布容積小, 組織內抗體濃度比體循環普遍低(除非組織抗原的富集), 組織中的殘余血液會對定量產生較大干擾,而有效的清除往往又會導致組織內抗體的損失。
Duan 等[11]使用nano LC-MS、有效的樣品制備和高通量肽段優化策略, 對小鼠7 個組織中的兩個mAb (8c2和cT84.66) 進行定量, 其LOQ 為0.156～0.312 μg·g-1組織, 該方法用于評估長期多劑量給藥后穩態下mAb的組織分布。
盒式給藥
如前所述, LC-MS 能夠同時定量多個靶蛋白, 因此能對候選藥物進行盒式給藥研究。對同一組動物注射多種藥物的盒式劑量可以極大地減少動物的用量,提高臨床前研究的效率和速度。
盒式給藥已被普遍用于篩選小分子藥物, 現在發現它更適合于候選mAb 的初步研究。這是因為多個mAb 的研究通常不會帶來藥物-藥物相互作用的風險, 蛋白質的PK 不受CYP450和轉運蛋白的影響; 且找到多個mAb 的最佳的共同配方是相當簡單的。
Jiang 等[13]開發并驗證了LC-MS 方法同時定量兩個共給藥的mAb, 該方法對兩個靶標都有良好的靈敏度、重現性和準確性。該方法應用于猴體內的毒代動力學研究, LC-MS 獲得的PK 圖譜與通過對每個抗體進行單獨的LBA分析獲得的PK圖譜高度吻合。
Li 等[61]在皮下注射盒式給藥的研究中, 血漿中的LOQ為0.1～0.5 μg·mL-1, 該方法在一次研究中可獲得4 個mAb 的PK參數。
