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鼠腦膠質瘤蛋白質及代謝物的超高分辨MALDI質譜成像
質譜成像技術被用于揭示膠質母細胞瘤組織切片的化學空間結構，并可直接進行組織分析定位神經膠質瘤及腫瘤惡性程度分級。
2017年4月，意大利比薩大學的M. Dilillo和荷蘭萊頓大學醫學中心L. A. McDonnell教授，在國際著名期刊Scientific Reports上發表了“Ultra-High Mass Resolution MALDI Imaging Mass Spectrometry of Proteins and Metabolites in a Mouse Model of Glioblastoma”的研究文章，使用超高分辨磁共振質譜和質譜成像方法對腦膠質瘤的蛋白標志物及代謝物定位和鑒定，這里為大家解讀一下這項研究工作。
文章簡介
《鼠腦膠質瘤蛋白質及代謝物的超高分辨MALDI質譜成像》
多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）是惡性程度最高的神經系統腫瘤，具有較高的浸潤性和異質性，臨床預后差。MALDI質譜成像已被證實應用于生物醫學研究領域，可以與組織學圖像相結合，使形態學信息與病理組織分子信息聯系起來，以確定與疾病、轉移狀態、患者預后和化療反應有關的分子變化。?
文章介紹了一種超高質量分辨率質譜MALDI-FTICR MSI（15T solariX XR）對小鼠膠質瘤模型中蛋白質成像的研究方法。通過布魯克15T solariX XR和MALDI-TOF MSI（ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF）兩種質譜儀分別對膠質瘤組織完整蛋白質進行成像，闡述了質量分辨率對檢測結果的影響，進一步通過激光顯微切割（Laser Capture Microdissection，LCM）技術，獲取健康和腫瘤組織微區域，與LC-MS/MS的分析結果相比對，提高鑒定結果的可信度。
MALDI 成像方法
對于完整蛋白質的MALDI MSI，根據Enthaler方案清洗組織切片, 除去組織表面的鹽和高含量的脂質, 使用芥子酸（SA）基質。對于代謝物成像，使用9-氨基吖啶（9-AA）基質，對于神經遞質和氨基代謝物的成像，在經過2,4-二苯基吡喃銨四氟硼（DPP-TFB）衍生化后施加2,5-二羥基苯甲酸（DHB）基質。大分子蛋白質MALDI質譜成像在布魯克15T solariX XR和ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF質譜儀上進行，正模式，125μm像素點，15T solariX XR在m/z 16000可達到同位素分辨率。小分子代謝物在9.4T solariX XR質譜儀上成像，正模式測定神經遞質和氨基代謝物，負模式測定腺苷酸和TCA循環中間體。MALDI質譜成像后的組織切片樣本用70%乙醇洗去基質后，用甲酚紫溶液染色，在玻片掃描儀上記錄高清組織學圖像。腫瘤和健康組織蛋白組學樣本使用激光捕獲顯微切割LCM獲得，收集在EP管中，用順磁珠SP3方法制備蛋白組酶切樣本。
質量分辨率對于分析病理組織中完整蛋白的重要性
對于完整蛋白，與MALDI-TOF MSI相比較，MALDI-FTICR MSI可以獲取更豐富的譜圖信息，它可以同時獲取蛋白同位素的空間分布，而在MALDI-TOF成像譜圖數據中只表現為一個寬峰，或檢測不到，而這些蛋白可能分布在腫瘤區域，是腫瘤標志物或是一個新的靶點。在腫瘤和健康區域，分別通過MALDI-FTICR MSI采集數據，可以迅速獲取蛋白的表達差異，而在整個組織切片的平均譜圖中無法顯示。還可以檢測蛋白質不同存在形式和帶電荷情況，如組蛋白的甲基化和乙酰化分別與組蛋白的不同存在形式和電荷狀態有關，而相同蛋白不同電荷下的空間分布相同，鑒定結果也可以得到很好的內部驗證。對于分子量相似的含同重素蛋白的分布也可以通過MALDI-FTICR MSI進行檢測。
MALDI MSI與LCM-LC-MS/MS聯用，提高可信度
組織切片在MALDI成像、LCM切割和蛋白提取酶切后，基于自下而上（Bottom-up）的方式，經LC-MS/MS進行對蛋白進行鑒定。從FTICR MSI采集的健康和腫瘤區域數據中提取出平均譜圖。將FTICR MSI測定的蛋白質離子的精確質量和同位素分布與LC-MS/MS法測定的蛋白質的理論質量和同位素分布進行同區域間的比較。所有蛋白質離子的比對都基于較高的質量精度，<10ppm，以及實驗和理論同位素分布之間的高相關性（在Matlab中執行，相關系數r≥0.95）。通過MALDI MSI檢測的，同時考慮由于PTMs（單甲基化，二甲基化，三甲基化，組蛋白乙酰化），化學修飾（單和雙氧化，二硫鍵和脫酰胺化），以及加合物（Na+，K+，基質加合物）可能導致的質量偏移。
MALDI-FTICR MSI數據與LCM-LC-MS/MS結果進行比對，分析結果的一致性突出了MALDI MSI研究中與癌癥相關的其他蛋白質。鑒定了胸腺素β4（m/z 4964.3）和胸腺素β10（m/z 4937.3），胸腺素β4的表達被認為是抗膠質瘤治療的一個新的分子靶點，而胸腺素β10參與了腫瘤細胞胃動素的調控，因此被認為與多種腫瘤的侵襲和轉移有關。還鑒定了許多核糖體蛋白質，小亞基和大亞基（40s和60s）的核糖體蛋白質在許多不同的癌癥中都有較高水平的表達，包括膠質瘤和其他腦腫瘤。
代謝研究的新思路
腫瘤細胞新陳代謝的變化是癌癥的標志。基于LCM-LC-MS/MS蛋白質組學分析揭示了一些蛋白質參與代謝途徑，表現出不同的表達水平。已鑒定的蛋白質的作用通過PANTHER分類系統追溯到特定的途徑。這些蛋白質是參與谷氨酰胺合成過程和 TCA 循環的酶。
應用MALDI-FTICR MSI對代謝物進行成像，在正離子模式下檢測神經遞質和氨基代謝物，負離子模式下檢測腺苷酸和TCA循環中間體。腦組織中腫瘤區域和健康區域的比較證實了涉及許多不同代謝途徑的代謝物的差異調節，并與生物合成底物產量的增加促進增殖相一致。如通過MALDI-FTICR MSI檢測到葡萄糖-6-磷酸/果糖-6-磷酸酯（結構異構，質量難以區分）信號的增加與糖酵解葡萄糖攝取量的增加一致。葡萄糖-6-磷酸可以轉化為3-磷酸甘油酸，然后通過兩個步驟轉化為甘氨酸: 兩者都在腫瘤中較高的水平被發現。
MALDI-FTICR MSI具有超高的分辨率和質量精度，而MALDI-TOF MSI具有更高的采集速度和質量范圍。我們可以根據實際需求選擇合適的儀器。
以上內容源自：
[1] Ultra-High Mass Resolution MALDI Imaging MassSpectrometry of Proteins and Metabolites in a Mouse Model of Glioblastoma,Scientific Reports. 2017, 7(1):603.
Doi: 10.1038/s41598-017-00703-w
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