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干貨來啦！AAV感染小鼠腸道及注射劑量指南

吉凱基因

2021.10.27

近期，小編接觸到很多老師咨詢腸道方向的AAV的注射方式，本期我們將對腸道的病毒感染方式及AAV參考劑量進行總結。

首先，我們了解一下腸道系統的結構，小腸全長約4-6米，分為十二指腸、空腸和回腸三部分；上連胃幽門，下接盲腸隨后連接大腸（包括盲腸含闌尾、升結腸、結腸右曲、橫結腸、結腸左區、降結腸、乙狀結腸、直腸）。

常見感染腸道的注射方式主要分為4種，分別為尾靜脈注射、腹腔注射、灌腸和腸系膜動脈注射[1，2]。其中系統性的遞送途徑包括尾靜脈注射和腹腔注射，這兩種注射方式操作簡單，但不具有特異性，除了腸道其他組織器官也有可能感染，同時病毒的損耗也會比較大：

一、尾靜脈注射

尾靜脈注射是常見的的系統性注射方式，通過這種方式可以感染全身的大多數器官，它的優點是操作簡便，對動物的損傷較小，缺點是無法實現特異性感染，尤其是肝臟、血管等更易感。

具體步驟如下（來源于吉凱平臺）：

尾靜脈注射示意圖（圖片來源于吉凱）

1. 實驗前準備

準備內容：小鼠、小鼠固定器 ( 或 50ml 離心管）、1ml 注射器、酒精棉球、病毒 ( 冰浴融化）、生理鹽水或 PBS。

2. 小鼠固定

a. 首先提取小鼠尾巴，將其放在鼠籠蓋或手臂上，并進行適當安撫；

b. 然后將小鼠裝入固定器 ( 可用 50ml 離心管改造）中，蓋緊蓋子，并使其尾巴朝外露出；

c. 用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使其血管擴張 ( 也可用熱水、加熱器等）。

3. 病毒注射

a. 用生理鹽水或 PBS 將病毒稀釋至合適滴度 ( 控制病毒注射體積在100-200μl）；

b. 用 1ml 注射器吸取 100~200μl 病毒；

c. 將小鼠尾巴拉直使其紅色靜脈清晰可見，在距尾尖 1/3 處進針，緩慢注入病毒后拔出，用棉球按壓注射點 1min 左右以止血。

4. 動物恢復

將小鼠從固定器上取下，放回原飼養籠中。

二、腹腔注射

腹腔注射的方式適用于脂肪、肌肉、胰腺、腸道等全身器官，以及新生鼠（造成的損傷較小），通過這種遞送途徑，腸道的平滑肌及漿膜感染概率更大，可以觀測到散在的GFP染色，但是上皮細胞感染的概率較小。

具體步驟如下（來源于吉凱平臺）：

腹腔注射示意圖（圖片來源于吉凱）

1. 實驗前準備

準備內容：小鼠、病毒液 ( 冰浴融化）、1ml 注射器。

吸取病毒：用 1ml 注射器吸取適量病毒，置于冰上備用。

2. 小鼠固定

a. 首先提取小鼠尾巴，將其放在鼠籠蓋或手臂上，并進行適當安撫；

b. 然后左手握小鼠，用拇指和食指捏住小鼠頸背部，用無名指及小指固定其尾和后肢，確保小鼠軀體舒展且不能亂動。

3. 病毒注射

a. 右手取吸好病毒的注射器，翻轉左手使小鼠頭部朝下且腹部完全暴露給操作者；

b. 手持注射器在下腹部離腹白線約 0.5cm 處下針，使針頭與小鼠腹部約成 30°夾角刺入腹部，刺入過程中如感覺到抵抗力突然消失，表明針頭已進入腹腔，此時調整針頭方向約與小鼠腹部平行，緩緩進針；

c. 針頭進入適當距離后，勻速注射病毒液后，緩緩拔出針頭 ( 旋轉針頭以避免漏液）。

4. 動物復蘇

將小鼠放回原飼養籠中，注意觀察小鼠狀態。

除了系統性的遞送方式外也可通過局部注射的方式實現AAV的遞送，腸道方向包括灌腸和腸系膜動脈注射的方式，優點是病毒劑量更小、可以直接感染需求部位，但同時也具備一定的缺點，那就是對動物造成的損傷更大。

三、灌腸

有文獻報道通過灌腸的方式感染腸道組織，由于需要通過小鼠肛門插管進行灌腸，因此感染深度具有一定的局限性，感染結腸的概率更大，一般小鼠劑量推薦4E10vg/只以上，體積200μl。

具體步驟如下（來源于參考文獻[1,3,4]）：

1. 實驗前準備

準備內容：小鼠、病毒液 ( 冰浴融化）、聚乙烯導管。

吸取病毒：用 1ml 注射器吸取適量病毒，置于冰上備用。

2. 病毒注射

a．首先使用異氟醚麻醉小鼠；

b．然后將聚乙烯軟管插入距離離肛門4厘米深的小鼠結腸部位，使用注射器緩慢注入適量的病毒；

c．注射完畢后，將小鼠在垂直倒立狀態保持1分鐘以上，以確保病毒在結腸部位的均勻分布；

d. 待小鼠復蘇后可以恢復正常飲水及飲食。

四、腸系膜動脈注射

腸系膜動脈是分布于消化管的動脈，主要分為腸系膜上動脈和腸系膜下動脈，結合小腸結構圖來看，腸系膜上動脈分布于小腸左側，腸系膜下動脈分布于結腸、大腸及泄殖腔部位，因此通過該方法可以感染小腸及結腸部位的細胞。

具體方法如下（來源于參考文獻[1,2,5]）：

a. ?保定完成后使用異氟醚麻醉小鼠；

b. ?通過左上方的皮膚進行1-2 cm的穿刺沿著腋線和側腹的脾臟區域。切開腹外斜肌暴露SMA（腸系膜動脈）。使用微型牽開器將皮膚和腹壁固定，并用溫暖的鹽水紗布覆蓋小腸防止回縮；

c. ?使用微血管放大器在放大20倍的情況下，將SMA輕輕地從腹膜后剝離，在近端傷口周圍放置連接注射針，使用一個微型血管鉗暫時夾閉血管腹主動脈；

d. 將定制33號1/2‘’英寸點式2型進樣針（Hamilton; Reno, NV)）連接250 μl漢密爾頓TLL氣密性進樣針注射器插入腸系膜動脈，輕輕結扎血管保持穩定防止注射泄漏，隨后進行病毒注射；

e. ?注射結束后取下注射器械，解除夾閉，使血液流回腸道組織。

腸系膜動脈注射示意圖

最后，小編對腸道系統的AAV注射方法及劑量進行總結，大家可以根據自己需求進行選擇預實驗的參考劑量，設置梯度，選擇最佳劑量：

?腸道系統AAV感染范圍及劑量參考

注射方法

感染部位

參考劑量

注射體積

尾靜脈注射

全身大部分器官、血液系統

＞2E11vg/只

小鼠100-200μl

灌腸

結腸更易感（少量腸上皮細胞感染）

4E10vg-1E11vg/只

小鼠200μl

大鼠700 μl

腹腔注射

腹腔腸道平滑肌、漿膜感染

（無上皮細胞感染）

＞1E11vg/只

50-100μl（不超過10 μl/g）

腸系膜動脈注射

腸系膜上動脈

小腸左側（可感染上皮細胞）

5E10vg-1E11vg/只

100-200μl

腸系膜下動脈

結腸（更易感）、大腸、泄殖腔（可感染上皮細胞）

【參考文獻】

[1] Polyak S , Mah C , Porvasnik S , et al. Gene delivery to intestinal epithelial cells in vitro and in vivo with recombinant adeno-associated virus types 1, 2 and 5.[J]. Digestive Diseases and Sciences, 2008, 53(5):1261-1270.

[2] Steven P , Annette M , Stacy P , et al. Identification of adeno-associated viral vectors suitable for intestinal gene delivery and modulation of experimental colitis[J]. American Journal of Physiology Gastrointestinal & Liver Physiology, 2012, 302(3):296-308.

[3] Zheng X , Lv Y , Li S , et al. Adeno‐associated virus‐mediated colonic secretory expression of HMGB1 A box attenuates experimental colitis in mice[J]. Journal of Gene Medicine, 2016.

[4] Zheng X Y , Lv Y F , Li S , et al. Recombinant adeno-associated virus carrying thymosin β4 suppresses experimental colitis in mice[J]. World Journal of Gastroenterology, 2017, 23(2):242.[5] Porvasnik S L , Mah C , Polyak S . Targeting murine small bowel and colon through selective superior mesenteric artery injection[J]. Microsurgery, 2010, 30(6):487-493.