活細胞熒光成像的新型標記法及其在STED中的應用（二）
圖5.EGFR在細胞中轉運的實時記錄。（a）示意圖，用于解釋如何利用FAPL探針來實時追蹤EGFR相關的細胞膜轉運過程。（b）COS7細胞中表達的EGFR用DRBG-488標記（綠色），溶酶體用lysosometracker（紅色）標記。（c）對表達SNAP-EGFR–CFP的MDCK細胞進行共聚焦實時成像。SNAP-EGFR-CFP用DRBG-488進行標記。在5min時加入了EGF刺激細胞，每個1min拍攝一次熒光圖像。相對于CFP的成像，DRBG-488能夠更清楚的記錄EGF刺激之后囊泡的形成及其在溶酶體里的聚集。
為了能夠消除自發熒光，更清楚的對更深的組織甚至是活體動物進行熒光成像，科學家們對近紅外染料的研發從未止步過[16]。Johnsson等科學家最近基于sillion-rhodamine熒光基團，推出了一款新的細胞膜通透性的近紅外染料（SiR）[17]。在未與SNAP-tag等標簽結合之前，成聚集狀或者與疏水結構非特異性結合的SiR會處于不發熒光的螺甾內酯狀態；一旦與標簽蛋白結合，SiR將處于兩性離子狀態，而發出很強的熒光（圖6）。將SNAP-tag的底物標記SiR便形成了SiR-SNAP。因此，利用SiR-SNAP對活細胞進行標記時，背景熒光非常低，從而免除了清洗步驟，實現實時的熒光探測。同時由于其光譜的近紅外特性，可以應用于深層組織，如大腦切片的成像（圖7）。
圖6. （A）SiR的兩種形式。（B）SiR的激發光譜（藍色虛線）和發射光譜（紅色實線）。
圖7. SiR-SNAP標記的大鼠腦片。a,子宮內原位電轉示意圖。紅色方框內的區域即為b圖中進行熒光成像的區域。b,通過子宮內原位電轉將SNAP和GFP的質粒以1:1的比例導入到E16期的神經元前體細胞中。對E19期的大鼠腦組織進行了切片并用SiR-SNAP和Hoechst進行了染色。c,對b圖中黃色方框區域的放大，GFP和SiR-SNAP的良好共定位驗證了SiR-SNAP標記的特異性。
SiR在STED超高分辨率顯微成像中的應用
Johnsson及其同事也將SiR-SNAP應用到STED超高分辨率顯微鏡對中心體蛋白Cep41的活細胞成像中[17]（圖8）。共聚焦圖像顯示SiR-SNAP標記的U2OS細胞中的Cep41-SNAP在微管及中心體中均有定位（圖8b）。STED超高分辨率顯微鏡發現SNAP-Cep41以環形排列在中心體上，該環形的直徑為175±13nm （n=7），這說明Cep41定位于微管形成的中心粒壁上（圖8d）。Z軸方向成像顯示由SNAP-Cep41形成的結構大約長440±28nm （n=16），這與已經報道的中心粒的長度是一致的，這說明Cep41形成的環形結構貫穿于整個中心粒。
圖8. U2OS活細胞中Cep41的共聚焦及STED成像。a, 中心體結構示意圖。b,SiR-SNAP標記的Cep41和Hoechest 33342標記的細胞核的雙色共聚焦圖像。c,結合于微管的Cep41的共聚焦及STED熒光圖像。d,位于中心體的Cep41的共聚焦及STED熒光圖像。標尺，500nm。
