在色譜定量分析中,選用峰高法還是選用峰面積法呢?這主要取決于在檢測器的線性范圍內,峰高和峰面積測量的準確性與重復性。除了歸一化法最好用峰面積法外,其他三種定量方法中峰高和峰面積都可用作精確的定量方法。
如何準確測量峰高與峰面積
在檢測器的線性范圍內,峰高和峰面積測量的準確性受色譜分離度的影響,要準確地測量峰高和峰面積,色譜分離應達到一定的分離度才行。圖2-3-18至圖2-3-22給出了峰高比1:1至16:1時的標準分離度曲線,每張圖上的黑點表示了每個峰峰尖的真實位置,此黑點與圖中所示的峰尖的垂直位移就是測量誤差。峰高比越大,要求能準確測量峰高的分離度也越大。峰高比為1:1和2:1時,峰高能得到準確測量的最低分離度為0.8;峰高比為4:1時,峰高能得到準確測量的最低分離度為1.0;峰高比16:1時,峰高能得到準確測量的最低分離度為1.25。關于分離度對峰高測定準確度的影響大致可認為:當分離度Rs-1.0時,相對峰高從128:1變化到1:128時,峰高的測量誤差小于+-3%。
分離度對峰面積測量的影響較峰高要大,即,2-3-23給出了分離度Rs=1.0和不同峰高比時,面積較小峰的峰面積測量值為其真實面積的百分數(shù)。由圖可見,當峰高比大時,面積較小峰的峰面積測量準確度降低,此時測量較大峰的峰面積較準確,誤差不超過1%。小峰峰面積測量誤差都是負值,而大峰峰面積測量誤差都是正值。如果兩個重疊峰峰高比為x(x>1),則兩個峰峰面積測量誤差關系為:
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表2-3-12不同,h1/h2時測量小峰峰面積的相對誤差
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表2-3-13色譜分離參數(shù)對濃度型檢測器峰高和峰面積定量分析精度的影響
由表2-3-13數(shù)據(jù)可看出:當流動相(GC的載氣,HPLC的洗脫液)流速可以準確控制,而影響容量因子(k')的一些因素(如,GC的柱溫、HPLC的流動相的組成)不能保持恒定(如,使用GC的程序升溫,HPLC的梯度洗脫)時,用峰面積定量較好;而當容量因子(k')和柱效(n)保持不變,流動相流速不穩(wěn)定,有微小變化時,峰高受到的影響要小于峰面積,此時用峰高定量能得到較為精確的定量結果。當柱效(n)有所變化時,使用峰面積定量可得到較精確的結果。
相對峰面積和絕對峰面積的區(qū)別
其實這個是絕對量與相對量之間的關系;
內標法當中,內標峰代表一定的濃度,那么相對峰面積乘以校正因子就可以換算出待測物的濃度,可以抵消進樣量誤差的影響;
外標法當中用絕對峰面積;必須能夠較好的控制進樣量差異,絕對峰面積就是一個成分一定量的響應值,對比已知定量的相應響應值就可以得到樣品含量。
HPLC得到的出峰時間和峰面積,說明了什么?
出峰時間:表示的是出峰的物質和柱的吸附關系,時間越長,吸附越緊密;
峰面積:表示的進樣中該出峰物質的含量,面積越大,含量越高;
追問:出峰時間越長,指的是出峰前時間越長還是出峰之后時間越長,吸附的越緊密?
指的是出峰的時間,如果出峰后的時間長,說明進樣量太多了,峰形也不好。
色譜定量分析中,峰面積和峰高定量有什么區(qū)別?
峰高指衍射峰頂點到背景線之間的高度;峰面積則指峰在背景線以上部分的總面積,也稱積分強度。在進行定量計算時,用積分強度(峰面積)更加準確,因為峰寬會受到樣品晶粒尺寸大小影響,從而影響到峰高。比方說某一混合物中含有材料A,含量固定,則A的峰面積應當是一樣的,但A晶粒尺寸小時由于峰寬化,峰高自然會比晶粒尺寸大的情況下要矮。
小結
總之,在分離度較好,色譜峰形較好,峰面積可以準確測量時,以用峰面積法定量為好。特別是在氣相色譜使用程序升溫和液相色譜使用多元梯度洗脫時,最好使用峰面積法定量。但當分離度不好,色譜峰形不好(如,嚴重拖尾)時,峰面積測量引起的誤差較大,此時使用峰高法定量較好。保留時間短的色譜峰峰形較尖(峰尾寬較小),此時峰高測定較峰面積測定準確,宜用峰高法定量;而保留時間長的色譜峰峰形較寬(峰尾寬較大),此時峰面積測定較峰高測定準確,宜用峰面積法定量。